Desenho racional de antivirais: identificação de novos inibidores contra a protease do vírus do Nilo Ocidental por high-throughput screening
Data
2021-03-03
Autores
Guimarães, Marcela 
Orientadores
Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
O vírus do Nilo Ocidental é um vírus de RNA, com um genoma composto por 11.029 nucleotídeos, envoltos em um capsídeo interno de 35nm. Ele é mantido em um ciclo de transmissão pássaro-mosquito-pássaro, pelo qual apenas algumas espécies de mosquitos Culex conduzem a transmissão para os seres humanos: Culex pipiens, C. quinquefasciatus e C. tarsalis. O vírus é capaz de replicar e provocar patologias no cérebro através de mecanismos potenciais de neuroinvasão, que incluem a interrupção da integridade da barreira hematoencefálica por citocinas vasoativas. Os sintomas da febre do Nilo incluem febre de início abrupto, mialgia, linfadenopatia, erupções maculopapulares não pruriginosas, meningite, encefalite, poliomielite e paralisia flácida aguda. No hemisfério ocidental, o vírus se espalhou de seu local de descoberta, em 1999 na cidade de Nova York, para a costa do Pacífico em 2003 e na Argentina em 2005. No Brasil, a presença de aves migratórias provenientes da região sul dos Estados Unidos sinaliza para o risco de introdução e transmissão do vírus do Nilo Ocidental, abrindo para discussão de ocorrências dessa arbovirose. A possibilidade de estudos in silico e os grandes avanços na área de varredura experimental de inibidores propiciaram o desenvolvimento de estratégias de estudo racional de novos fármacos pela possibilidade de identificação e otimização de moléculas pequenas com capacidade de interação com o alvo molecular de interesse. A protease do vírus do Nilo Ocidental pertence à família das serino-proteases e está localizada na porção N-terminal da NS3, contendo 179 resíduos de aminoácidos em sua sequência. A NS3pro é ativa apenas em complexo com o cofator NS2b, um peptídeo de 40 resíduos de aminoácidos que promove estabilidade e integra a fenda de ligação do substrato. Sendo uma importante proteína do metabolismo viral, e não encontrada nas células do hospedeiro, torna-se interessante a sua utilização como alvo molecular. A NS2b-NS3pro foi obtida de forma recombinante através da transformação do gene em E. coli BL21 (DE3), seguida de expressão e purificação por cromatografia de afinidade. Após estabelecimento de ensaios bioquímicos, a protease foi utilizada para realização das varreduras de inibidores em placas de 384 poços, usando a biblioteca de compostos orgânicos da Spectrum Collection (MicroSource Discovery Systems), com 2320 compostos bioativos com amplo espectro de cobertura. Seguindo parâmetros pré-estabelecidos, foram obtidos 24 resultados positivos (“hits”), que posteriormente foram confirmados por ensaios de IC50.