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    Acesso aberto (Open Access)
    Avaliação da interação entre o papilomavírus bovino e a célula hospedeira
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-02-27) Melo, Thatiana Correa de [UNIFESP]; Kerkis, Irina Kerkis [UNIFESP]; Stocco, Rita de Cássia; http://lattes.cnpq.br/8807278169991830; http://lattes.cnpq.br/2425111638231335; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Bovine papillomaviruses (BPVs) are oncogenic virus, with epithelium and mucous tropism, associated to benign lesions which can progress to malignancy, principally in presence of the environmental co-factors. Currently, there are 13 types of BPV described, classified in three genres: Delta, Epsilon and Xipapillomavirus. Objectives: This study aimed to identify the interaction between the BPV with primary cell cultures, as well as the virus with peripheral blood cells from bovines infected by BPV with different clinical characteristics of bovine papillomatosis. The viral activity was evaluated through the BPV proteins expression, morphological alterations and levels of clastogenicity. Methods: Samples of peripheral blood and tissue were collected from bovines uninfected by BPV, as well as, animals with cutaneous papillomas, esophagus and urinary bladder papillomas. The tissue samples were submitted to histopathological analysis and BPV detection. Primary cell cultures of each tissue sample were stablished and submitted to the investigation for lineage characterization by morphology, cytoskeletal (vimentin, cytokeratin, E-cadherin, ?-cathenin and actin), focal adhesion (vinculin), expression of E7 oncoprotein, replication (E2 e E1^E4) and capsid protein (L1) of BPV. Cell circle alterations, the levels of clastogenicity and the virus particle presence were analyzed in these systems. Results and Discussion: the presence of viral DNA, in episomal state, was detected in the passages of cell culture (P1-P6). Furthermore, the viral proteins expression was detected by RT-PCR, immunofluorescence and flow cytometry. Oncoprotein E7 was identified in cytoplasmatic region, the E2 and E1^E4 proteins were identified in the nucleus and cytoplasm and the L1 protein was present in nuclear and perinuclear region of culture cell and peripheral mononuclear cells (PBMCs). These same proteins were detected in paraffined tissue, being observed in epithelium and dermis. High levels of clastogenicity were identified both in cell culture and PBMCs in all groups of animals with papillomas, but not detected on uninfected bovines. Electron microscopy analysis showed the presence of structures very similar to virus particles. Culture cells from animals infected by BPV showed double labeling of vimentin/cytokeratin and alteration in the labeling standard of E-cadherin and ?-cathenin. Specifically, ?-cathenin was expressed in the cytoplasm and nucleus. These data suggest that these cells could be suffering an epithelial-mesenchymal transition (EMT). The EMT is responsible for the invasion/migration of cells with transformed phenotype, contributing to the metastasis genesis. Furthermore, the culture cells infected by BPV showed nuclear and depolarized F-actin. The protein was retracted in the cellular matrix. The presence of lamelipoids was detected. Probably, these alterations are result of viral protein activity. Conclusion: DNA virus presence in the passages, morphologic alterations and clastogenicity, as well as, the presence of BPV particles and protein expression represent strong evidences that the virus is active, occurring virus assembling in vitro. Alterations in cytoskeleton proteins and co-expression of proteins of epithelial and mesenchymal origin point out that the culture cells are suffering neoplastic modifications, characterized by EMT.
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    Acesso aberto (Open Access)
    O papel da espécies reativas de oxigênio e do antioxidante astaxantina em oócitos bovinos submetidos ao estresse térmico in vitro
    (Universidade Federal de São Paulo, 2013-08-21) Ispada, Jessica [UNIFESP]; Lopes, Fabiola Freitas de Paula [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Condições ambientais adversas, tais como temperatura e umidade elevada, limitam a exploração do máximo potencial genético animal. Em bovinos, o estresse térmico materno compromete a fertilidade de vacas leiteiras, resultando em prejuízos econômicos para indústria de leite. Sabe-se que o oócito e o embrião no estágio pré-implantacional inicial são os principais alvos dos efeitos deletérios causados pelo estresse térmico materno, entretanto, os mecanismos celulares desencadeados pela temperatura elevada e o papel do estresse oxidativo neste contexto são pouco conhecidos. Estudos recentes indicaram que a exposição de embriões bovinos ao choque térmico aumentou a concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular embrionária e o uso de antioxidantes, tais como a astaxantina, reverteram estes efeitos. Com isto, o presente estudo visou avaliar os efeitos do choque térmico e do antioxidante astaxantina durante a maturação in vitro (MIV) de oocitos bovinos na (1) concentração das EROs, (2) competência oocitária, (3) atividade de enzimas antioxidantes e (4) peroxidação lipídica em complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos. O experimento 1 avaliou os efeitos de diferentes concentrações de astaxantina (0, 50, 100, 200 ou 500 µM) na competência oocitária à 38,5°C (etapa 1) e os efeitos de diferentes concentrações de astaxantina (0, 12,5, 25, 50, 100 ou 50 000 nM) na competência de oocitos bovinos submetidos ao choque térmico (etapa 2). As doses de 100, 200 e 500 µM de astaxantina reduziram (P< 0,05) a proporção de embriões clivados que atingiu o estágio de blastocisto. A exposição de oocitos bovinos ao choque térmico reduziu (P< 0,05) as taxas de clivagem e blastocistos. No entanto, a adição de astaxantina em oocitos submetidos ao modelo de choque térmico resgatou a clivagem embrionária (P<0,05); doses de 12,5, 25, 50, 100 e 50 000 nM de astaxantina) e o desenvolvimento a blastocisto (P< 0,05; doses de 12,5 e 25 nM de astaxantina) quando comparadas ao grupo controle-veículo 41°C. O experimento 2 visou padronizar a técnica de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) em CCOs bovinos. Para tanto, foram realizados vários estudos preliminares a fim de estabelecer o protocolo de RPE em CCOs. No entanto, não foi possível detectar as EROs em CCOs na maioria dos procedimentos conduzidos. Quando CCOs submetidos aos tratamentos Controle (38,5°C por 14 horas) e Choque Térmico (41°C por 14 horas) foram incubados com 100 µM do pró-oxidante menadiona e 50 mM de PBN em meio MIV e PBS 10 mM 1:1 as EROs foram detectadas apenas no grupo choque térmico. Os experimentos 3 e 4 avaliaram os efeitos da astaxantina (0, 12,5 e 25 nM) e da temperatura (38,5 ou 41°C) durante as primeiras 14 horas da MIV na atividades das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase - SOD, glutationa peroxidase - GPX e catalase - CAT) e os níveis de peroxidação lipídica no meio MIV. O choque térmico não afetou a atividade das enzimas GPX, SOD e CAT em oócitos ou células do cumulus e a taxa de peroxidação lipídica no meio MIV. Em oocitos submetidos ao choque térmico as doses de 12,5 (P=0,09) e 25 nM (P<0,05) astaxantina estimularam a atividade de GPX quando comparado aos oócitos do grupo controle veiculo 41°C. Em contraste, a dose de 25 nM de astaxantina reduziu (P<0,05) a atividade de GPX em células do cumulus independente de temperatura. A atividade da enzima SOD foi estimulada (P<0,05) em oocitos do grupo controle maturados com 25 nM de astaxantina em relação a 0 nM de astaxantina. A dose de 12,5 nM de astaxantina estimulou (P<0,05) a atividade de SOD em oocitos do grupo choque térmico em relação a mesma dose no grupo controle. O perfil de atividade da SOD em células do cumulus variou com a dose. Enquanto a dose de 12,5 nM de astaxantina inibiu a SOD,a dose de 25 nM estimulou a atividade de SOD no grupo choque térmico. Houve tendência (P=0,09) da dose de 12,5 nM de astaxantina em aumentar a atividade de CAT em oócitos apenas durante o choque térmico. Foi também observada uma tendência da dose de 12,5 nM de astaxantina em aumentar (P= 0,09) a formação do MDA/TBA no grupo estressado termicamente, quando comparado a mesma dose durante a temperatura controle. Em conclusão, o choque térmico afetou a competência oocitária e a astaxantina reverteu esse efeito resgatando a competência oocitária. É possível que este efeito da astaxantina tenha sido mediado pelo aumento na atividade de enzimas GPX, SOD e CAT em oócitos submetidos ao choque térmico. As vias pelas quais este antioxidante exerce efeito termoprotetor ainda não foram completamente compreendidas.