Navegando por Palavras-chave "Detergentes"
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- ItemAcesso aberto (Open Access)Estudo do papel da interação eletrostática no processo de solubilização de membranas miméticas por detergentes com cargas diferentes(Universidade Federal de São Paulo, 2023-10-16) Oliveira, Maria Clara Araújo [UNIFESP]; Riske, Karin do Amaral [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9178927522709552; http://lattes.cnpq.br/2314524859774065Introdução: Detergentes são moléculas anfifílicas capazes de solubilizar membranas biológicas, separando seus componentes. Estudos com sistemas biomiméticos são importantes para a compreensão dos aspectos físico-químicos do processo de solubilização de membranas. A maioria desses estudos se limita ao uso de lipídios neutros, como a fosfatidilcolina (PC). No entanto, é sabido que biomembranas possuem uma fração de lipídios aniônicos, como o fosfatidilglicerol (PG), e vários detergentes comumente empregados são iônicos. Objetivo: Estudar o processo de solubilização de bicamadas lipídicas neutras e aniônicas por detergentes com cargas nula, positiva e negativa. Materiais e métodos: Foram utilizadas vesículas unilamelares grandes (LUVs) e gigantes (GUVs) compostas por PC (zwiteriônico), PG (aniônico) e mistura PC:PG 1:1, e os detergentes aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS), catiônico brometo de cetil trimetil amônio (CTAB) e não-iônico octil glicopiranosídeo (OG). O processo de solubilização foi estudado por medidas de turbidez, microscopia ótica e técnicas calorimétricas. Resultados: Medidas de turbidez de LUVs ao longo da titulação com os detergentes mostraram que as membranas aniônicas foram mais suscetíveis à solubilização que as zwiteriônicas, já que foi necessária uma concentração menor de todos os detergentes para causar a solubilização completa. A partir da microscopia ótica de GUVs observamos que o detergente OG, não-iônico, causa um aumento da superfície da vesícula devido a um rápido flip-flop, seguido da solubilização completa da membrana. Por outro lado, os detergentes iônicos geraram uma explosão súbita das GUVs, pois se inserem apenas na monocamada externa, o que leva a um aumento da tensão da membrana. A técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) permitiu a obtenção do calor associado à partição dos detergentes em LUVs antes do início do processo de solubilização. O processo de incorporação do detergente OG foi sempre endotérmico e semelhante para as três composições de membrana, mas apresentou uma afinidade um pouco maior pelas membranas aniônicas. Já os detergentes iônicos, SDS e CTAB, apresentaram resultados sensíveis à interação eletrostática. O CTAB apresentou um processo de incorporação exotérmico, com uma intensidade muito maior para membranas aniônicas, devido à atração eletrostática. O processo de inserção do SDS passou de exotérmico em membranas zwiteriônicas para endotérmico em membranas aniônicas. A técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) permitiu avaliar o efeito dos detergentes na transição gel-fluido das bicamadas. Os detergentes OG e SDS levaram a uma diminuição no valor da temperatura de transição com um alargamento dos picos. Foi necessária uma concentração menor desses detergentes para causar diminuição na entalpia da transição de membranas aniônicas. Por outro lado, a temperatura de transição de fase das membranas ficou praticamente inalterada na presença de altas concentrações de CTAB, mostrando um processo de solubilização incompleto. Conclusão: A interação eletrostática entre detergente e membrana não é preponderante no processo de solubilização e as membranas aniônicas (contendo PG) se apresentaram mais suscetíveis ao processo de solubilização, independentemente da carga do detergente.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Solubilização de membranas biomiméticas por detergentes com diferentes características físico-químicas(Universidade Federal de São Paulo, 2022-06-14) Oliveira, Mariana Silva e Silva de [UNIFESP]; Riske, Karin do Amaral [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9178927522709552; http://lattes.cnpq.br/6155559170182005Detergentes são moléculas anfifílicas amplamente usadas em protocolos de solubilização de biomembranas, que possibilitam a extração de componentes presentes nas membranas para diversos estudos. Existe uma ampla gama de detergentes disponíveis, os quais possuem variadas características físico-químicas e podem atuar de diferentes formas na solubilização de membranas biológicas. Da mesma forma, as membranas celulares também são diversas, pois são constituídas por diferentes tipos de lipídios e podem apresentar variadas propriedades como, por exemplo, característica mais fluida, como na fase líquido-desordenada (Ld), ou de caráter mais ordenado, semelhante à fase líquido-ordenada (Lo), que pode ocorrer em microdomínios transientes chamados de rafts lipídicos. O uso de membranas biomiméticas, modelos mais simplificados de bicamadas lipídicas, possibilita uma investigação mais direcionada com resultados interessantes para pesquisas biomédicas. Previamente, nosso grupo estudou em detalhe o processo de solubilização de membranas pelo detergente Triton X-100 (TX-100) e mostrou que ele é capaz de solubilizar membranas na fase Ld, mas não na fase Lo, e que em misturas ternárias ele induz separação de fases Ld/Lo com posterior solubilização apenas da fase Ld. O presente trabalho usa como comparação o TX-100 e estende as investigações para outros detergentes de diferentes características físico-químicas: Triton X-165, C10E5, Tween 20, Dodecil Maltosídeo (DDM), Octil Glicosídeo (OG) (não-iônicos), SDS (aniônico), CHAPS (zwiteriônico) e CTAB (catiônico). As composições das membranas submetidas à solubilização por esses detergentes foram de fase Ld (POPC puro), fase Lo (SM:Col, 7:3) e mistura ternária (POPC:SM:Col, 2:1:2). Dois métodos foram usados para avaliar a interação dos detergentes com essas membranas: medição da turbidez (espalhamento de luz a 90º) apresentada por vesículas unilamelares grandes (LUVs) ao longo da titulação com os detergentes escolhidos e microscopia óptica para observar vesículas unilamelares gigantes (GUVs) na presença dos detergentes em diferentes concentrações. A partir das análises de turbidez com LUVs de POPC, viu-se que a maioria dos detergentes não-iônicos podem aumentar a turbidez da amostra antes de gerar a esperada redução, que é associada à solubilização das bicamadas. Por microscopia óptica, observou-se que esse aumento da turbidez está relacionado com o aumento da área superficial das vesículas, ocasionado pela inserção dos detergentes nas duas monocamadas da membrana. Outros detergentes (os iônicos SDS e CTAB e com a cabeça polar mais volumosa DDM) inserem-se apenas na monocamada mais externa de POPC, levando na maioria dos casos ao rompimento da bicamada e resultando em fragmentos insolúveis que estabelecem uma turbidez residual. Por outro lado, os detergentes OG e CHAPS, apesar de suas cabeças polares também volumosas, também causaram aumento da área superficial das GUVs, embora pequeno para o CHAPS. Supõe-se que o translocamento desses detergentes pelas monocamadas possa ser favorecido pela abertura transiente de poros. Praticamente todos os detergentes foram capazes de solubilizar as membranas de POPC, com exceção do CTAB e SDS que apresentaram valores residuais de turbidez mesmo em relações detergente/lipídio muito altas. Por outro lado, nenhum detergente foi capaz de solubilizar completamente as membranas de SM:Col, na fase Lo, sendo que o C10E5 foi o que causou maior solubilização dessa composição. Quando investigadas as interações com vesículas de composição ternária, o que se constatou foi que os detergentes que promovem a explosão das bicamadas de POPC fazem o mesmo com as membranas ternárias, enquanto que os detergentes que se inserem nas duas monocamadas e aumentam a área superficial da fase Ld, previamente à sua solubilização, também promovem a separação das fases Ld e Lo nas bicamadas de composição ternária, solubilizando na sequência preferencialmente a fase Ld. Dessa forma, pudemos concluir que o caráter e tamanho da cabeça polar, e a habilidade do detergente em realizar uma taxa de flip-flop eficiente após sua inserção, modulam a habilidade dos detergentes em solubilizarem completamente bicamadas de POPC, e que a presença de colesterol diminui consideravelmente a solubilidade da membrana para todos os detergentes.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Solubilização de membranas modelo de diferentes composições pelo detergente triton X-100(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-03-29) Mattei, Bruno [UNIFESP]; Riske, Karin do Amaral [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9178927522709552; http://lattes.cnpq.br/4260343698344529; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Detergents are amphiphilic molecules widely used as solubilizing agents Biological membranes. However, biological membranes treated with detergents Ac-ese insoluble fragments rich in sphingolipids and cholesterol. Due to similarities of These features have been associated with lipid rafts and the liquid phase The. Here the study of the physical-chemical aspects that govern the process of UUilllCATiOn of membrane mimetic models: lipid vesicles of controlled composition Pure or mixtures, mainly POPC, SM and cholesterol). Many different Techniques were used to study the solubilization process of lipid vesicles by Detergent TX-100, one of the most used detergents in Biological membranes. The general phenomenon and the size of the structures formed during the Solubilization was obtained by turbidity, static and / or dynamic light scattering; The aspects Thermodynamic properties of the detergent-lipid interaction were investigated by titration calorimetry And the possible interference of the detergent in the phase transition of lipids was investigated Differential scanning calorimetry; The ability of detergents to permeabilize the The membrane was investigated by kinetics of leakage of a fluorescent probe and microscopy Confocal; The process of solubilization of giant vesicles was evaluated by optical microscopy of Phase contrast and fluorescence. In the work, different lipid compositions were investigated (Pure phospholipids, binary lipid mixtures and ternary lipid mixtures) in order to obtain Information on the factors that influence the obtaining of insoluble membrane fragments. Through the experiments it was possible to conclude that pure cell membranes (POPC and SM), reaching the liquid-disordered phase and gel are totally soluble to the action of Detergent, whereas the addition of cholesterol, inducing a higher degree of Lipids leads to conditions in which the membranes are partially or totally insoluble; The factor of Insolubility is conditioned to cholesterol concentration in vesicles with binary mixtures Of lipids, reaching total insolubility in situations in which the membrane tends or reaches the Liquid-ordered phase; This is also reflected in the detergent affinity constant for these Membranes. In addition, vesicles in the gel phase are solubilized with lower concentrations of TX-100 than vesicles in the liquid-disordered phase, possibly due to the lower Ability of the membrane to accommodate detergents; Added to this, the addition of detergent Also appears to induce a phase transition in vesicles in the gel phase and a coexistence of Fluid phases in POPC: cholesterol vesicles. In ternary lipid mixtures, the situations in Higher solubility resistance is observed in regions with Greater fraction of SM and cotesterol. Finally, the membranes become permeable in TX-100 / lipid molars lower than the solubilization process, showing that even before To reach the bi-co-existent phase of the membrane, the detergent already changes the membrane structure.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Solubilização de misturas lipídicas ternárias do tipo raft por detergentes não-iônicos(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-11-27) Carita, Amanda Costa [UNIFESP]; Riske, Karin do Amaral [UNIFESP]; Paula, Eneida de; http://lattes.cnpq.br/5343212477106568; http://lattes.cnpq.br/9178927522709552; http://lattes.cnpq.br/9984919762940829; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)O processo de solubilização de membranas biológicas é relevante para inúmeros protocolos bioquímicos. Em determinadas condições, algumas membranas apresentam resistência à solubilização, mesmo sob alta concentração de detergente. Esses fragmentos insolúveis, chamados de DRMs (membranas resistentes a detergentes), são ricos em esfingolipídios, colesterol e proteínas com preferência por ambientes mais organizados. A composição dos DRMs é similar à dos rafts, que são domínios funcionais de membrana envolvidos em diversos mecanismos celulares importantes, e à da fase líquido-ordenada de bicamadas lipídicas. Devido à complexidade do estudo dos rafts in vivo, as membranas modelo representam uma interessante opção para elucidar seu funcionamento. Aqui, realizamos o estudo de aspectos físico-químicos que regem o processo de solubilização de misturas lipídicas ternárias compostas pelos lipídios POPC (palmitoil oleoil fosfatidilcolina, um lipídio insaturado), SM (esfingomielina, um lipídio saturado) e colesterol em uma grande gama de composições. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) e grandes (LUVs) foram escolhidas como modelos de membrana para os ensaios de solubilização. O principal detergente utilizado neste trabalho foi o Triton X-100 (TX-100), amplamente empregado como agente solubilizador de membranas biológicas. Adicionalmente, os detergentes Brij 98, maltosídeo e octil-glicopiranosídeo (OG) também foram investigados. A principal técnica utilizada foi a microscopia óptica de GUVs. Em paralelo, alguns estudos de fluorescência e espalhamento de luz foram feitos em LUVs. Este trabalho teve como objetivo principal verificar se o TX-100 induzia a separação de fases líquido-desordenada/líquido-ordenada e quantificar a extensão de solubilização, à medida que a proporção dos lipídios era alterada na composição ternária. Foi possível observar que a adição de TX-100 aumenta consideravelmente a região de coexistência de fases macroscópica e a presença de SM e col tornam a mistura cada vez mais insolúvel. A técnica de FRET foi empregada para verificar a existência de domínios sub-microscópicos e compreender se a adição de detergente ampliava os domínios pré-existentes ou induzia sua formação. O espalhamento de luz estático também foi utilizado para monitorar o perfil de solubilização na mesma amostra. 5 Ademais, GUVs compostas por POPC puro e POPC:SM:col (4:2:4) foram escolhidas para estudos por microscopia óptica com os detergentes OG, maltosídeo e Brij 98. O foco aqui foi comparar os efeitos observados com o TX-100 com os demais detergentes não-iônicos. No processo de solubilização de GUVs de POPC ficou evidente como a natureza química do detergente influencia no processo de solubilização: o TX-100 possui a capacidade de ser incorporado em grande quantidade na bicamada e de solubilizá-la completamente. A partição do OG na membrana parece ser menor e seu caráter solubilizador foi menor, pois fragmentos insolúveis foram verificados. O maltosídeo, cuja cabeça polar é composta por um dissacarídeo, levou à ruptura da vesícula e o Brij 98 apresentou uma pequena partição na membrana mas não foi capaz de solubilizá-la. Os resultados com as GUVs de composição ternária mostraram que além do TX-100, os detergentes maltosídeo e OG induziram a formação de domínios, mas em proporções distintas dependendo do detergente. Dessa maneira, apesar de o uso de detergentes ser um fator importante para o estudo dos lipid rafts não é possível realizar uma associação direta entre as frações insolúveis resultantes desse processo e os rafts de membrana in vivo.