Navegando por Palavras-chave "Síntese de peptídeos"
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- ItemAcesso aberto (Open Access)Estudos de síntese, conformação e atividade biológica da gomesina e análogos através de diferentes metodologias(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2013) Domingues, Tatiana Moreira [UNIFESP]; Miranda, Antonio de [UNIFESP]; Riske, Karin do Amaral [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9178927522709552; http://lattes.cnpq.br/1357848049935882; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)O peptideo antimicrobiano gomesina (Gm) foi inicialmente isolado da hemolinfa da Acanthoscurria gomesiana, uma aranha caranguejeira encontrada no Brasil. Fortemente cationico, possui 18 residuos de aminoacidos (pGlu1-Cys-Arg-Arg-Leu5-Cys-Tyr-Lys-Gln-Arg10-Cys-Val-Thr-Tyr-Cys15-Arg-Gly-Arg-NH2) e duas ligacoes de dissulfeto nas posicoes Cys2,15 e Cys6,11. Trata-se de um PAM de largo espectro de acao, cuja atividade litica foi avaliada como elevada e rapida. Gm e analogos foram sintetizados pelo metodo em fase solida e utilizando-se a estrategia t-Boc. Em seguida, os peptideos foram clivados, purificados e caracterizados, alcancando-se um indice de pureza satisfatorio. Por meio de ensaios biologicos (de atividade antimicrobiana e hemolitica), estudos espectroscopicos e de cinetica de vazamento de carboxifluoresceina (CF), a Gm e todos os seus analogos foram avaliados, tendo sido possivel tracar uma relacao estrutura/atividade para esses peptideos, que comprova a importancia da manutencao das ligacoes de dissulfeto pelos analogos da Gm para o desempenho de uma boa atividade litica. Com base nesses primeiros resultados, a Gm e seu analogo menos ativo ([Ser2,6,11,15]-Gm) foram selecionados para analises mais detalhadas, utilizando-se, para tanto, modelos de membrana. Assim sendo, bicamadas lipidicas (LUVs), micelas e monomeros de SDS (dodecil sulfato de sodio) foram os sistemas mimeticos escolhidos para investigar o mecanismo de acao desses peptideos. A analise dos dados de calorimetria de titulacao isotermica (ITC) e de cinetica de vazamento de CF indicou forte interacao da Gm com as LUVs e rapida acao de desestruturacao dessas bicamadas, em um processo entalpicamente dirigido. Atraves da utilizacao das tecnicas de espalhamento de luz estatico e dinamico, e microscopia otica de contraste de fase, foi possivel detectar a formacao de grandes agregados lipidicos, mesmo em baixas razoes peptideo/lipidio. Com o intuito de minimizar a agregacao lipidica, um lipidio modificado contendo o polimero polietilenoglicol (PE-PEG2000) foi adicionado as vesiculas. A Gm tambem apresentou intensa ligacao exotermica (ITC) e uma alta taxa de permeabilizacao dessas bicamadas modificadas, alem de reduzida formacao de agregados. O analogo [Ser2,6,11,15]-Gm exibiu semelhante atividade a da Gm em interacao com LUVs contendo 50 mol% de POPG e uma diminuicao acentuada dessa atividade para LUVs com 25 mol% de POPG, reafirmando a importancia da atracao eletrostatica para esses peptideos. Alem disso, espectros de CD confirmaram que a Gm e seu analogo linear adotam conformacao em dobra beta quando em contato com lipossomas e SDS acima e abaixo da CMC (concentracao micelar critica). Em outros estudos, analises de fluorescencia e absorbancia de analogos ciclicos da Gm, marcados com um residuo de Trp, em presenca de diferentes concentracoes de SDS, apontaram para uma maior interacao desses peptideos com o SDS monomerico, resultando em um maior blueshift do espectro de emissao do Trp, bem como em um aumento na absorbancia das amostras, maior ou igual ao causado pelo SDS na forma micelar. O uso de dois sistemas mimeticos de membrana diferentes, bem como as diversas metodologias empregadas, foi fundamental para uma ampla investigacao das etapas requeridas pela Gm para causar a ruptura das biomembranas. Alem disso, esses estudos foram importantes na deteccao e caracterizacao da formacao de agregados durante a interacao da Gm com moleculas anfifilicas anionicas, agregacao essa que possivelmente se estende a outros peptideos cationicos, e que muitas vezes e negligenciada.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Estudos de síntese, conformação e atividade biológica de análogos do peptídeo antimicrobiano longipina(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-03-31) Silva, Jones Montenegro da [UNIFESP]; Miranda, Antonio de [UNIFESP]; Silva Júnior, Pedro Ismael da; http://lattes.cnpq.br/7158586957386749; http://lattes.cnpq.br/1357848049935882; http://lattes.cnpq.br/4701582072086750; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Longipina (Lp) é um potente peptídeo antimicrobiano isolado e caracterizado a partir da hemolinfa do Acustisoma longipe. É rico em lisina (K) e tirosina (Y) e sua sequência primaria é: SGYLPGKYVYKYKGKVF. O objetivo principal deste trabalho é estudar a relação estrutura-atividade de novos análogos da Lp, assim como entender os seus mecanismos de ação. Os peptídeos foram sintetizados pelo método de fase sólida manual e foram purificados e caracterizados por cromatografia líquida de fase reversa e por espectrometria de massas. As atividades antimicrobianas dos peptídeos foram avaliadas através de um ensaio de inibição de crescimento líquido contra P. aeruginosa, E. coli, S. marcescens, E. c1oacae, C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. neoformans, A. niger, C. herbarum e P. farinosus. As atividades hemolíticas e de resistência à degradação foram feitas, respectivamente, com hemácias e plasma humanos. Após uma análise dos resultados, observamos que os análogos: Ac_[Arg7,12,14,16]_Lp_NH2A,c_[Trp3,9,11,13]_Lp_NH2A;c_[Trp3,9,11,13A, rg7,12,14,16]_ Lp-NH2, Ac-[Des-Ser1, Trp3,9,11,13,Arg7,12,14,16]_Lp_NH2foram os mais ativos quando comparados com a Lp. Até a concentração de 100 IJM todos os compostos testados não apresentaram atividade hemolítica. Os análogos mais ativos foram também os mais resistentes à degradação em plasma. Concluímos que a acetilação e amidação e a substituição dos resíduos de Lys por Arg e de Tyr por Trp geraram análogos mais potentes e menos líticos. As perspectivas futuras são a realização dos estudos conformacionais por dicroísmo circular e a avaliação das atividades antitumorais dos compostos estudados.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Síntese, estudos conformacionais e atividade biológica de novos análogos do peptídeo antimicrobiano gomesina(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-08-31) Mendes, Roberta Brandao [UNIFESP]; Miranda, Antonio de [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1357848049935882; http://lattes.cnpq.br/9759007573287366; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Gomesin (ZCRRLCYKQRCVTYCRGR-NH2) is an antimicrobial peptide isolated from hemocytes of the Brazilian spider Acanfhoscurria gomesiana. The molecule has four cysteines that form two intramolecular disulfide bridges at positions 2.15 and 6.11. Gm has a broad spectrum of action and a high toxicity against human erythrocytes. This study aimed to the synthesis of new analogues of gomesin to evaluate their structure-activity and their mechanisms of action in comparison to Gm. Thus, linear and cyclic analogs were synthesized, Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15, Ac-Ifrp", D-Lys8]-Gm2-15, Ac- [Thr2,6,11,15]-Gm2_1A5c, -[ Thr2,6,11,15,D-Lys8]-Gm2_1a5nd Ac-[Thr2,6,11,15,D-Pro9]-Gm2_1b5y using the solid phase peptides synthesis in a t-Boc strategy. Then peptides were cleaved, purified and characterized. Antimicrobial activity were evaluated against C. albicans, B. megaferium, P. aeruginosa, P. expansum, C. neoformans, A. niger, Cladosporium sp and S. cerevisiae; hemolytic activity was determined against human erythrocytes; Peptides degradation resistance in human plasma and antitumoral activity against K562 cells were also evaluated. Structural analysis by Circular Dichroism spectroscopy and peptide/vesicle interaction using giant unilamellar vesicles and optical microscopy were also performed. Thermodynamical studies of the interaction peptide I lipid using large unilamellar vesicles (LUVs) was done by isothermal titration calorimetry (ITC). Our results showed that analogues, Ac-Gm2-15, Ac-[D-Lys8]-Gm2-15 and Ac-IIrp", D-Lys8]-Gm2-15, presented the best antimicrobial activity, particularly against microorganisms A. nigerand S. cerevisiae, their performance were even better than Gm. Ali showed low hemolytic activity even at 100 IJM concentration. They were quite resistant to degradation. Fro the Circular Dichroism studies, we observed that the cyclic compounds showed conformations similar than to gomesin, they also assume a p-hairpin conformation. On the other hand, linear analogues showed a prevalence of random conformation. The Iytic mechanism of action of Gm and Ac-Gm2-15 showed to be very similar, both of them caused a disruption of the membrane. Ac-[Thr2,6,11,15]-Gm2_1p5resented a pore formation mechanism. From our results, we had confirmed the crucial importance of the disulfide bridges in the Iytic mechanism of action; in fact its removal causes a decrease in the antimicrobial, hemolytic and antitumor activities. The disulfide bridges also have a great contribution to the stability and strength the action against plasma protease. Gomesin fragments should have less potency, maybe due to the lower amount of charge and also because of the removal of amino acids in the N- and C-terminal portions
- ItemAcesso aberto (Open Access)Síntese, estudos conformacionais e atividade biológica do peptídeo antimicrobiano oligoventina e análogos(Universidade Federal de São Paulo, 2023-11-14) Mendes, Roberta Brandão [UNIFESP]; Silva Junior, Vani Xavier da {UNIFESP]; Silva Junior, Pedro Ismael da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7158586957386749; http://lattes.cnpq.br/8202238208943023; http://lattes.cnpq.br/9759007573287366Introdução: A oligoventina é um peptídeo antimicrobiano (PAM) isolado a partir dos ovos da aranha armadeira Phoneutria nigriventer, contendo 8 resíduos de aminoácidos (Gln-Pro-Phe-Ser-Leu-Glu-Arg-Trp) e apresenta atividade contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e levedura e não apresenta atividade hemolítica. Objetivos: Estudar a relação estrutura-atividade da oligoventina e seus análogos, onde foram feitas modificações pontuais para tentar entender seu mecanismo de ação. Os peptídeos foram projetados com modificações C- e N- terminal; sínteses retro-inversas e D-aminoácidos e acrescentando cargas positivas por meio de substituições de arginina ao longo da cadeia (Arg-scan) para tentar melhorar sua atividade antimicrobiana. Metodologia: Os peptídeos foram sintetizados pela síntese em fase sólida, purificados por HPLC e caracterizados por LC/ESI-MS. Os estudos da atividade antimicrobiana foram determinados por ensaio de inibição de crescimento em meio líquido; os ensaio de atividade hemolítica foram realizados utilizando sangue recém coletado tipo A, fator RH positivo; os estudos de degradação utilizando plasma humano recém coletado com diferentes tempos de incubação (0, 1, 2 e 24 horas) ; os estudos conformacionais foram determinados por Dicroísmo circular em diferentes concentrações de TFE (0, 10, 30 e 50% de TFE/H2O) utilizando o espectropolarímetro e os ensaios de atividade antitumoral foram determinados contra células normais (Vero) e diferentes células tumorais ( K562, Jurkat, B16F10 e Neuro 2A) utilizando o Alamar BLUE e MTT para a viabilidade celular. Resultados: Analisando os resultados, na atividade antimicrobiana, quando comparados com a Ogv, que apresentou um CMI de 400 µM, os análogos que apresentaram uma atividade com CMIs melhores foram: Ac-Ogv-NH2 (12,5 µM), Ac-[Retro]-Ogv-NH2 (25 µM), Ac-[Des-Phe3]-D-Ogv-NH2(12,5 µM), Ac-D-Ogv-NH2 (50 µM),Ac-Ogv (100 µM), Ogv-NH2 (100 µM), [Arg2]-Ogv (100 µM), [Arg3]-Ogv (100 µM) e [Arg4]-Ogv (50 µM). Na atividade hemolítica, os análogos que apresentaram as melhores atividades, não apresentaram hemólise nas concentrações testadas, enquanto o restante, apresentou taxa de hemólise mais alta. Na degradação, os análogos com modificações C- e N- terminal que foram acetilados e amidados, respectivamente, foram mais estáveis e não degradaram em até 24 horas de ensaio, enquanto os peptídeos com extremidades livres, degradaram em 2 horas. Nas estruturações secundárias dos análogos testados, todos possuem estruturas randômicas, exceto o análogo [Arg4]-Ogv, cujo espectro apresentou uma conformação mais rígida, mas sem adquirir conformação específica. Contra as células tumorais eritroleucêmicas K562 e melanoma murino, os análogos não apresentaram resultados significativos. Contra as Jurkat, Ac-(Glu1)-Ogv-NH2 foi a que apresentou a maior atividade em comparação com a Ogv. Contra as células Vero, a Ogv preservou cerca de 73% de viabilidade celular, juntamente com todos os análogos testados. Já contra as células N2A, os análogo que apresentaram os melhores resultados foram a [Arg4]-Ogv, com viabilidade celular de 45%, a Ogv e o análogo Ac-[Retro]-Ogv-NH2 com 53% de viabilidade celular. Conclusão: Esses estudos apresentaram alguns análogos com resultados melhores que a Ogv, sendo eles: Ac-Ogv-NH2, Ac-D-Ogv-NH2, Ac-[Retro]-Ogv-NH2 e Ac-[Des-Phe3]-D-Ogv-NH2 com as melhores atividades antimicrobianas, não foram degradados e não apresentaram atividade hemolítica no MIC que possuem atividade. A [Arg4]-Ogv foi a que apresentou um amplo espectro de ação, contra todas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas testadas e a única que apresentou atividade contra fungo filamentoso e levedura. A acetilação e amidação dos peptídeos tiveram um papel fundamental na melhora da atividade antimicrobiana, hemolítica e resistência a degradação. Novos estudos se fazem necessários para elucidar e se obter um melhor entendimento sobre a atividade desse peptídeo.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Síntese, estudos conformacionais e do mecanismo de ação da gomesina(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-01-27) Domingues, Tatiana Moreira [UNIFESP]; Miranda, Antonio de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)A gomesina (Gm) é um potente peptídeo antimicrobiano catiônico. Este peptídeo e seu análogo linear [Ser2,6,11,15]-Gm, com menor atividade lítica, foram sintetizados pela metodologia da fase sólida, empregando-se a estratégia t-Boc. Neste estudo, investigamos a interação da Gm e da [Ser2,6,11,15]-Gm com vesículas unilamelares gigantes (GUVs), compostas por membranas lipídicas de POPC ou POPC/POPG, através de microscopias óticas de contraste de fase e fluorescência. As análises se dividiram em duas diferentes partes. Na primeira, observou-se o efeito da injeção de uma solução peptídica, com micropipeta, na vizinhança das GUVs. Como resultado da interação peptídeo/lipídio, as GUVs foram desestabilizadas e romperam-se rapidamente, sem observação de formação de poros estáveis durante todo o experimento. Nos estudos controles, em ausência de peptídeo, as GUVs não romperam de forma espontânea. Peptídeos marcados com a sonda fluorescente rodamina (Rh) foram injetados e mostram que a Gm primeiramente acumula-se na superfície da vesícula, na qual, então, pequenas partículas de alto-contraste são formadas e ocorre, eventualmente, a destruição das GUVs. Este fato leva-nos a especular que a Gm rompe as membranas via modo carpete. Na segunda parte, uma solução contendo GUVs foi misturada a crescentes concentrações peptídicas para quantificação da ação lítica destes peptídeos em vesículas de diferentes composições lipídicas. O efeito de atividade lítica observado foi maior que 90% em baixas concentrações tanto de Gm quanto de [Ser2,6,11,15]-Gm em GUVs compostas de POPC, lipídio eletricamente neutro, e de uma mistura de POPG, negativamente carregados, a POPC em diferentes proporções. Estudos conformacionais foram feitos por duas técnicas espectroscópicas distintas: dicroísmo circular (CD) e fluorescência. A Gm e seu análogo linear aparentemente interagiram com as cargas negativas de SDS nas concentrações acima e abaixo da CMC. Os espectros de CD da [Ser2,6,11,15]-Gm em água apresentaram uma banda fortemente negativa em 198 nm, indicando tratar-se de uma estrutura desordenada, como esperado para peptídeos livres em solução, e não de uma dobra beta como apresentada pela Gm. A partir dos resultados obtidos, foi possível concluir que ambos os peptídeos analisados interagem com vesículas compostas por fosfolipídios e induzem o vazamento de seu conteúdo interno dependentemente da carga de membrana destas, o que corrobora estudos prévios que sugerem que as interações eletrostáticas com a bicamada lipídica dos micro-organismos representam um importante papel no mecanismo de ação da Gm.