Navegando por Palavras-chave "Sinalização intracelular"

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    Peptídeos intracelulares como novos moduladores da transdução de sinal de receptores acoplados à proteína G
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2008-05-28) Cunha, Fernanda Marques da [UNIFESP]; Ferro, Emer Suavinho [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A degradacao de proteinas pelo sistema ubiquitina-proteassoma gera uma grande quantidade de oligopeptideos dentro das celulas. Para investigar possiveis efeitos desses oligopeptideos, alguns deles foram isolados do cerebro de rato, sintetizados acoplados a sequencia peptidica TAT atraves de pontes dissulfeto, sendo entao analisados nas vias de transducao de sinal de receptores acoplados a proteina G. A mistura contendo os quatro peptideos analisados (20-80 ƒÊM) inibiu de forma significativa o aumento da taxa de acidificacao do meio extracelular induzido pela angiotensina II em celulas CHO-S que expressam o receptor AT1 (CHO-S-AT1). Adicionalmente, tanto sozinhos quanto em mistura, estes peptideos aumentaram a transcricao do gene reporter da luciferase induzida pela angiotensina II em celulas CHO-S-AT1, assim como aquela induzida pelo isoproterenol em celulas HEK293. Os peptideos sem TAT, incapazes de atravessar a membrana das celulas, nao alteraram as respostas a estimulacao dos receptores, sugerindo um efeito intracelular dos peptideos nas cascatas de transducao de sinal. Alem disso, todos os peptideos estudados inibiram competitivamente a degradacao de um substrato sintetico da oligopeptidase EP24.15 in vitro. O aumento da expressao da EP24.15 em celulas CHO-S e HEK293 foi suficiente para reduzir a atividade do gene reporter luciferase induzida pela angiotensina II ou pelo isoproterenol. Finalmente, a utilizacao dos peptideos como gisca h em colunas de afinidade revelou que diversas proteinas envolvidas na sinalizacao de receptores acoplados a proteina G interagem com os peptideos, incluindo a adaptina A-alfa e a dinamina-1. Estes resultados sugerem que antes de serem completamente degradados, os peptídeos intracelulares semelhantes àqueles gerados pelo proteassoma podem afetar ativamente a sinalização intracelular, delineando-se como novas moléculas bioativas dentro das células.
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    Sinalização de cálcio mediada pela enzima conversora de angiotensina I
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2008-11-26) Guimarães, Paola Bianchi [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A enzima conversora de angiotensina (ECA) é uma metaloproteinase que tem um papel importante na homeostase circulatória, uma vez que é capaz de modular a estrutura de uma diversidade de compostos, entre eles, angiotensina I (Ang I), convertendo-a no octapeptídeo vasopressor angiotensina II (Ang II), e inativando a bradicinina (BK), um peptídeo vasodilatador. Apesar de várias décadas de estudos, novos aspectos do mecanismo de ação da ECA foram elucidados, expandindo nosso conhecimento sobre seu papel, não só na regulação cardiovascular, mas também em outras diferentes áreas. Trabalhos recentes têm mostrado que a ECA pode também ser considerada uma molécula transdutora de sinal, uma vez que, tanto seu substrato endógeno BK (Fleming I, 2006), quanto vários de seus inibidores são capazes de gerar sinais intracelulares com subseqüente alteração de expressão gênica de algumas proteínas. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo verificar se o substrato natural da ECA, a Ang I, seria capaz de ativar a enzima em células CHO transfectadas permanentemente com a ECA recombinante, levando a uma sinalização intracelular mediada pela liberação ou entrada de cálcio. Com a utilização de fluoróforos indicadores de sinais de cálcio intracelular (Ca2+ i), observou-se que a administração de Ang I leva a um aumento de Ca2+ i, cuja resposta extinguiu-se com a incubação prévia do inibidor da ECA lisinopril. Verificamos também o aumento de Ca2+ i, quando se administrou Ang II, a qual foi capaz de se ligar à enzima, em ensaios de ligação. A hipótese dessa sinalização ocorrer via receptores de Ang II tipo 1 (AT1) foi descartada, uma vez que, não foi observada a expressão do RNAm ou proteína para esse receptor nas células transfectadas. Em resumo, nossos resultados mostram pela primeira vez a liberação de cálcio como segundo mensageiro pela ativação da ECA pela Ang II. Esse estudo evidencia um novo aspecto da biologia da ECA e abre novas perspectivas de estudo, em relação à importância fisiológica desta sinalização.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Vias de sinalização intracelular envolvidas no efeito proliferativo de relaxina em células de sertoli
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2011-03-30) Nascimento, Aline Rosa [UNIFESP]; Lazari, Maria de Fatima Magalhaes [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Relaxin is an insulin-related peptide that activates the G-protein coupled receptor RXFP1. Although relaxin plays an important role in female reproduction its physiological role in the male reproductive system is still unclear. We have previously demonstrated that relaxin and RXFP1 are expressed in testis (FILONZI et al., 2007; CARDOSO et al., 2010). Both relaxin and RXFP1 have been immunolocalized to Sertoli and germ cells, suggesting that relaxin may be important for spermatogenesis. In fact, relaxin induced proliferation of Sertoli cells in culture. G-protein coupled receptors may activate cell proliferation by several mechanisms: transactivation of tyrosine kinase receptors and/ or activation of intracellular signaling kinases that culminates in the activation of MAP Kinase (ERK1/2) or PI3K pathway. The aim of the present study was to investigate the signaling events that lead to the proliferative response of relaxin in rat Sertoli cells. Primary culture of Sertoli cells was obtained from 15-day old Wistar rats. Cells were incubated in the absence or presence of increasing concentrations of relaxin (25-200 ng/ml), for different periods (5, 10, and 30 min), at 35°C. To characterize upstream pathways to ERK1/2 phosphorylation, cells were previously treated with the inhibitor of MEK1/2, U0126 (20 ìM for 30 minutes; N=3); the inhibitor of the kinase activity of the EGF receptor (EGFR) AG 1478 (1 ìM for 15 minutes; N=4); the inhibitor of Src family of tyrosine kinases, PP2 (5 nM for 30 minutes; N=4); the inhibitor of metalloproteases, GM 6001 (200 nM for 30 minutes; N=4); the PI3K inhibitor, wortmannin (100 nM for 30 minutes; N=5); the inhibitor of PKA, H89 (2 ìM for 2 hours; N=5); the general PKC inhibitor, GF 109203X (5 ìM for 30 minutes; N= 3) or the inhibitor of Gi/o, pertussis toxin (PTX, 100 ng/ml for 16 h; N=2). ERK1/2 phosphorylation was determined by Western Blot analysis. Relaxin increased ERK1/2 phosphorylation in a time and concentration-dependent fashion. The peak of ERK1/2 phosphorylation occurred at 5 minutes, and with 50 ng/ml of relaxin (N=3). ERK1/2 phosphorylation induced by relaxin was inhibited by pre-treatment with AG 1478, PP2, wortmannin, GF 109203X and pertussis toxin, but not with H89 and GM 6001. The effect of relaxin on Sertoli cell proliferation was determined by incubation of the cells with 50 ng/ml relaxin, for 24 hours, and by determination of the methyl [3H] thymidine incorporation, in the absence or presence of key inhibitors of the ERK1/2 pathway. Celll proliferation mediated by ERK1/2 was inhibited by the MEK1/2 inhibitor, UO126, and by the PI3K inhibitor, wortmannin. Other inhibitors of the ERK1/2 pathway such as the PKC inhibitor GF 109203X and the inhibitor of the tyrosine kinase of EGFR, AG1478, were not effective. Our results suggest that relaxin stimulates ERK1/2 phosphorylation and PI3K pathways, and that PI3K plays a central role in relaxin mitogenic effect in Sertoli cells. We propose the following sequence of events for the stimulatory role of relaxin in Sertoli cell proliferation: coupling of the stimulated RXFP1 with a Gi protein, release of âã subunits and activation of PI3K, which in turn can phosphorytale and activate PKC, Src and Ras. All these pathways can lead to Raf/MEK/ERK activation, and Src can phosphorylate EGFR, which may also contribute to ERK1/2 activation. ERK1/2 may regulate transcription of genes related to cell cycle regulation. Alternatively, PI3K may also activate transcription of genes that regulate the cell cycle. Further studies are necessary to clarify the mechanisms involved in the cell cycle regulation and cell proliferation induced by relaxin. This event certainly plays a central role in spermatogenesis and male (in)fertility and relaxin emerges as a novel paracrine/autocrine hormone that regulates Sertoli cell function.