Análise da Diversidade Genética em Agentes da Esporotricose Usando Marcadores Aflp (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Data
2020-03-10
Autores
Carvalho, Jamile Ambrosio De 
Orientadores
Camargo, Zoilo Pires De
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Sporothrix is a thermodimorphic fungus found in the environment which causes sporotrichosis, a subcutaneous mycosis that can be transmitted to humans directly from contaminated soil or plants through traumatic inoculum from fungal propagules or through bites and scratches from contaminated cats. The genus is divided into two clades, a clinical clade represented by S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa, and S. luriei, and an environmental clade represented by species rarely described as human pathogens. Considering the ongoing epidemic occurring in Brazil, mostly caused by S. brasiliensis, it is necessary to use techniques to explore diversity within the species. The existing techniques for this type of study have high costs, we aimed to standardize the AFLP technique for application in Sporothrix. AFLP is based on genomic DNA digestion using one or more restriction enzymes and selective amplification of the fragments generated using selective molecular primers with the addition of one or more nucleotides to the 3' region of these primers. The technique has been used for several microorganisms and has advantages as not requiring the knowledge of the sequence of isolates. To reduce costs and time, firstly, an in silico AFLP was performed to predict the fragments that would be generated and thus to choose the nucleotide combinations that presented more efficiency to separate the isolates by species. For this, we use two softwares: AFLPinSilico and ISIF. The two softwares were compatible with each other and both revealed six combinations that showed good results for studies in Sporothrix. These combinations were tested in vitro and all obtained good results, but only three were selected to continue the study with 188 isolates of Sporothrix from different geographic regions. In general, the study presented three new markers that demonstrated efficiency in separating Sporothrix by species and accessing the intraspecific diversity in the species of the clinical clade, clarifying questions of the expansion of S. brasiliensis.
O Sporothrix é um fungo termodimórfico encontrado na natureza e que causa a esporotricose, micose subcutânea que pode ser transmitida para o ser hu*-mano diretamente do solo ou plantas contaminadas por meio de inóculo traumático de propágulos fúngicos ou por meio de mordidas e arranhaduras de gatos contaminados com a doença. O gênero é dividido em dois clados, um clado clínico representado por S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa e S. luriei, e um clado ambiental, representado por espécies raramente descritas como patógenos de humanos. Considerando a epidemia em curso ocorrendo no Brasil, em sua maioria causada por S. brasiliensis, se torna necessária a utilização de técnicas para explorar diversidade dentro da espécie. Tendo em vista que as técnicas existentes para esse tipo de estudo possuem custos elevados, objetivamos padronizar a técnica AFLP para aplicação em Sporothrix. O AFLP é baseado na digestão do DNA genômico por uma ou mais enzimas de restrição e amplificação seletiva dos fragmentos gerados utilizando iniciadores moleculares seletivos com a adição de um ou mais nucleotídeos a região 3‟ desses iniciadores. A técnica vem sendo empregada para diversos microorganismos e apresenta vantagens como não necessitar do conhecimento da sequência dos isolados. Para diminuir custos e tempo, primeiramente foi realizada a técnica AFLP in silico a fim de prever os fragmentos que seriam gerados e assim optar por combinações de nucleotídeos que apresentassem mais eficiência para separar os isolados por espécie. Para isso utilizamos dois softwares: AFLPinSilico e ISIF. Os dois softwares foram compatíveis entre si e ambos revelaram seis combinações que apresentaram bons resultados para estudos em Sporothrix. Essas combinações foram testadas in vitro e todas obtiveram bons resultados, mas foram escolhidas apenas três para a continuação do estudo com 188 isolados de Sporothrix de diferentes regiões geográficas. Em geral, o estudo apresentou três novos marcadores que se demonstraram eficientes em separar os isolados de Sporothrix por espécie e acessar diversidade intraespecífica nas espécies do clado clínico, elucidando questões da expansão de S. brasiliensis.
O Sporothrix é um fungo termodimórfico encontrado na natureza e que causa a esporotricose, micose subcutânea que pode ser transmitida para o ser hu*-mano diretamente do solo ou plantas contaminadas por meio de inóculo traumático de propágulos fúngicos ou por meio de mordidas e arranhaduras de gatos contaminados com a doença. O gênero é dividido em dois clados, um clado clínico representado por S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa e S. luriei, e um clado ambiental, representado por espécies raramente descritas como patógenos de humanos. Considerando a epidemia em curso ocorrendo no Brasil, em sua maioria causada por S. brasiliensis, se torna necessária a utilização de técnicas para explorar diversidade dentro da espécie. Tendo em vista que as técnicas existentes para esse tipo de estudo possuem custos elevados, objetivamos padronizar a técnica AFLP para aplicação em Sporothrix. O AFLP é baseado na digestão do DNA genômico por uma ou mais enzimas de restrição e amplificação seletiva dos fragmentos gerados utilizando iniciadores moleculares seletivos com a adição de um ou mais nucleotídeos a região 3‟ desses iniciadores. A técnica vem sendo empregada para diversos microorganismos e apresenta vantagens como não necessitar do conhecimento da sequência dos isolados. Para diminuir custos e tempo, primeiramente foi realizada a técnica AFLP in silico a fim de prever os fragmentos que seriam gerados e assim optar por combinações de nucleotídeos que apresentassem mais eficiência para separar os isolados por espécie. Para isso utilizamos dois softwares: AFLPinSilico e ISIF. Os dois softwares foram compatíveis entre si e ambos revelaram seis combinações que apresentaram bons resultados para estudos em Sporothrix. Essas combinações foram testadas in vitro e todas obtiveram bons resultados, mas foram escolhidas apenas três para a continuação do estudo com 188 isolados de Sporothrix de diferentes regiões geográficas. Em geral, o estudo apresentou três novos marcadores que se demonstraram eficientes em separar os isolados de Sporothrix por espécie e acessar diversidade intraespecífica nas espécies do clado clínico, elucidando questões da expansão de S. brasiliensis.