Estudo da funcionalidade da GTPase Ras de Paracoccidioides brasiliensis em condicoes de estresse oxidativo e nitrosativo
Data
2012
Autores
Haniu, Ana Eliza Coronel Janu 
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Paracoccidioides brasiliensis e o agente etiologico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistemica prevalente na America Latina. Fungos patogenicos devem apresentar a capacidade de se adaptarem a mudancas dramaticas do ambiente no hospedeiro infectado. Moleculas que exercem acao fungicida no fagossoma, tais como peroxido de hidrogenio (H2O2), oxido nitrico (NO) e seus derivados, sao componentes importantes neste processo. Consequentemente, proteinas com funcoes antioxidantes podem proteger as celulas dos fungos contra o estresse oxidativo/nitrosativo gerado pelas celulas fagociticas, atuando como fatores de virulencia potenciais. Tais eventos muitas vezes sao desencadeados por vias de sinalizacao ainda nao totalmente compreendidas no fungo. Neste contexto, a proteina Ras desempenha grande papel. Ras esta envolvida com resposta ao estresse, a morfologia das celulas e diferenciacao de uma variedade de organismos. As proteinas da subfamilia Ras sao GTPases monomericas que funcionam como interruptores moleculares nas vias de transducao de sinais. O ciclo ordenado da atividade das proteinas Ras depende de duas reacoes: (1) troca de nucleotideo (GDP por GTP), que ativa a proteina, e (2) hidrolise de GTP, que transforma a Ras ativa, ligado ao GTP, na sua forma inativa, ligada ao GDP. Ras, na sua forma ativada, interage com varias proteinas efetoras e pode iniciar uma cascata de quinases. Em eucariotos inferiores, a quinase Byr2 representa um homologo de mamifero alvo Ras Raf-quinase. O presente trabalho investigou o papel de Ras de P. brasiliensis apos estimulo in vitro com ROS ou RNS. Nos demonstramos que as baixas concentracoes de H2O2 (0,1 mM) ou NO2 (0,1-0,25 μM) estimularam a proliferacao de P. brasiliensis quando comparadas com as celulas de leveduras nao tratadas. Proliferacao celular nao foi observada no fungo, quando as celulas leveduriformes foram pre-incubados com FTPase III (inibidor farmacologico Ras). Para confirmar o envolvimento de Ras neste processo foi construido neste trabalho uma sonda que detecta a forma ativada de Ras (Ras-GTP). Para tanto o dominio RBD de Byr2 foi fusionado ao GST (RBD-Byr2-GST). Esta construcao funciona como uma sonda para identificar Ras em sua forma ativada em celulas de P. brasiliensis. Celulas leveduriformes foram incubadas na presenca ou ausencia de 0,1 mM de H2O2, ou 0,25 μM de NO2 (pH 5,6) e a forma ativa de Ras foi analisada por western blot. Em ambas as condicoes, encontramos a forma ativada de Ras apos a estimulacao. Alem disso, observou-se que apos tratamento com NO2 Ras foi detectada S-nitrosilada, o que nao foi observado apos estimulacao com H2O2. Portanto, podemos concluir que baixas concentracoes de ROS/RNS podem ativar Ras e consequentemente levar a proliferacao celular do P. brasiliensis. Este evento poderia desempenhar um importante papel no desenvolvimento do fungo bem como na progressao da PCM
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Citação
São Paulo: [s.n.], 2012. 127 p.