Estresse oxidativo como indutor da transição epitélio-mesemquimal em célula tubular renal
Data
2013-06-26
Autores
Carrasco, Flavio Balbera 
Orientadores
Silva Filho, Alvaro Pacheco e Silva Filho
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
A nefropatia crônica do enxerto (NCE) é um grande obstáculo para o estabelecimento de longa sobrevida do transplante. A característica histológica que mais se associa ao declínio da função renal nesta patologia é a fibrose túbulo-intersticial (FTI) e atrofia tubular (AT). Estudos recentes sugerem que alguns miofibroblastos intersticiais derivam de células epiteliais tubulares renais que passaram pelo processo de transição epitelial-mesenquimal (TEM). Uma série de insultos incluindo o estresse oxidativo (OS), como o peróxido de hidrogênio (H2O2), e a exposição a citocinas pró-inflamatórias, como o fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1), contribuem para a patogênese da fibrose em NCE. Além disso, o papel de substâncias antioxidantes na inibição da TEM tem sido alvo de diversos estudos. O presente estudo teve como objetivo a análise da ação do estresse oxidativo no processo de TEM in vitro e a supressão da transformação fibroblástica, ou seja, da TEM, frente a inibidores de EROs com a utilização de antioxidante. Para tal, células de linhagem humana oriundas do epitélio proximal tubular renal (HK-2) foram tratadas com H2O2 para indução da TEM e o TGF-1 foi utilizado como estímulo para controle positivo. As doses e tempos de tratamento foram estabelecidos por testes de viabilidade utilizando cristal violeta e a constatação da TEM foi dada por microscopia óptica, ensaios de motilidade celular, imunoblotting e imunocitoquímica com a marcação de moléculas relacionadas ao processo da TEM tais como citoqueratina, tipicamente expressa no citoesqueleto de células epiteliais, e vimentina, característica de células mesenquimais. O tratamento das células HK-2 com H2O2 e TGF-β1, resultou em alteração da morfologia celular à microscopia óptica, de um aspecto cubóide, tipicamente epitelial, a fusiforme, característico de células mesenquimais. Ensaios de viabilidade evidenciaram dose subletal de H2O2 de 0,10 mM/mL; contudo, quando submetidas ao teste de microscopia óptica e mobilidade celular, o tratamento com H2O2 nas doses de 0,25 e 0,50 mM/mL por 48 e 72 horas proporcionaram os melhores resultados, sem evidência de morte celular com tais doses. Tais resultados foram corroborados pela análise por imunocitoquímica, na qual as células submetidas ao estresse oxidativo por 48 e 72 horas com H2O2 e TGF-β1 tiveram uma diminuição significante da expressão de citoqueratina e aumento da expressão de vimentina, achados também confirmados através de immunoblotting, corroborando a capacidade de indução da TEM pelo OS. Em contrapartida avaliamos a capacidade de uma substância antioxidante, a N-acetilcisteína (NAC), em inibir o processo de TEM induzido pelo H2O2 utilizando imunocitoquímica, de modo que o pré-tratamento com NAC por 1 hora foi suficiente para a inibição da TEM observada através da persistência da expressão de citoqueratina e inibição da expressão da vimentina nas células epiteliais em estudo, quando expostas por 48 e 72 horas ao estímulo com TGF-b e H2O2. Em conclusão, as alterações morfológicas características da TEM puderam ser induzidas pelo estresse oxidativo com H2O2, em células epiteliais tubulares renais em cultura. Além disso, o processo de TEM neste modelo foi eficientemente inibido pelo tratamento com NAC, um antioxidante, sugerindo o papel fundamental do estresse oxidativo na TEM e a possibilidade terapêutica para prevenção dos eventos biológicos deletérios relacionados à TEM. Novos estudos em outros modelos são ainda necessários para a elucidação dos mecanismos envolvidos, bem como a efetividade e segurança para a aplicabilidade clínica de tais conceitos.
Descrição
Citação
CARRASCO, Flavio Balbera. Estresse oxidativo como indutor da transição epitélio-mesemquimal em célula tubular renal. 2013. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2013.