Caracterização da presença de AKT no núcleo de células de melanoma e identificação de proteínas associadas por espectrometria de massas
Data
2016-08-16
Autores
Coa, Larissa Leggieri 
Orientadores
Machado Junior, Joel
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
The serine threonine kinase AKT/PKB is a critical regulator of various essential physiological cellular processes including cell proliferation, survival, motility and size, metabolism and differentiation. Deregulation of this pathway has been implicated in many diseases including cancers. Despite AKT action is acknowledged to function mainly in the cytoplasm, where most of its known substrates are located, AKT has been reported to translocate to the nucleus of various cell types. Therefore, AKT functions may be achieved through distinct subcellular compartments, providing spatial specificity in the mediation of biological effects. However, very little is known about the mechanism required for the nuclear import of AKT. Also, the interaction of AKT with proteins that reside in the nucleus has not been well explored as well as how its kinase activity modulates signaling in this compartment. Thus, identification of additional targets or binding proteins of nuclear AKT may provide a better understanding of it functions in the nucleus. In the present study we characterized the presence of endogenous nuclear AKT in two human melanoma cell lines harboring distinct genetic backgrounds (A2058, PTEN mutant/deleted; Mewo, PTEN wild-type). Our results showed that either phosphorylated and non-phosphorylated forms of AKT are present in melanoma cells nuclei, suggesting that phosphorylation of AKT is not required for its nuclear localization. Using co-immunoprecipitation (Co-IP) combined with crosslinking and mass spectrometry we identified a series of putative protein partners of nuclear AKT. Functional groups of proteins with known nuclear role emerged, such as RNA-binding proteins involved in transcription and pre-mRNA processing [e.g. heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) and Serine/arginine-rich splicing factors (SRSF)], proteins required for ribosome biogenesis and rRNA processing (Ribosomal proteins), as well as cytoskeleton proteins (e.g. Actin, Vimentin and F-capping subunit ?). We validated ?-actin as a bona fide nuclear AKT-interacting partner. We also provided evidences that proteins such as cofilin and RNA polymerase II, known to interact and work in concert with ?-actin in the nucleus, also couple with nuclear AKT. Considering that nuclear actin has been described to have a key role regulating nuclear process such as chromatin remodeling, transcription, RNA processing and export, our findings provide new insights into the possible direct involvement of AKT in the transcriptional network of nuclear actin.
A serina/treonina quinase AKT/PKB é uma das principais proteínas de sinalização envolvidas na regulação de diferentes processos celulares como proliferação, sobrevivência, motilidade, metabolismo e diferenciação. A desregulação da atividade de AKT tem sido associada na patogênese de diversas doenças, incluindo cânceres como melanoma. Apesar do seu papel fisiológico bem definido no citoplasma, onde vários dos seus substratos são encontrados, diversas evidências mostram que AKT também migra para o núcleo em diversos tipos celulares. Assim, as funções de AKT podem ocorrer em compartimentos celulares distintos, proporcionando especificidade espacial na mediação dos seus efeitos biológicos. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos que regulam a localização e transporte de AKT para o núcleo, com quais proteínas interage e como influencia nas funções nucleares. Neste trabalho caracterizamos a presença de AKT no núcleo de duas linhagens celulares de melanoma humano que apresentam perfis genéticos distintos (A2058, PTEN deletado; Mewo PTEN selvagem), bem como investigamos proteínas nucleares alvos de interação com AKT. Nossos resultados revelaram a presença de AKT endógeno no núcleo de ambas as linhagens de melanoma e análises do perfil de AKT fosforilado no seu resíduo de serina473 mostraram que a fosforilação de AKT não é necessária para sua localização nuclear. Por meio de experimentos de co-imunoprecipitação combinada com crosslinking químico e espectrometria de massas LC-MS/MS identificamos diversas proteínas putativas que interagem com o AKT nuclear. Dentre essas, proteínas com função no splicing de mRNA, proteínas ribossomais, ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas (hnRNP) e proteínas do citoesqueleto como a ?-actina. A interação entre AKT e ?-actina foi confirmada por ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência confocal. Além disso, nossos resultados também mostram evidências que proteínas como cofilina e RNA polimerase II, conhecidas por interagir com a ?-actina nuclear, também colocalizam com o AKT no núcleo. Considerando o papel da ?-actina nuclear na regulação de importantes processos nucleares como remodelagem da cromatina, transcrição, exportação e processamento de mRNA, nosso estudo demonstra de forma inédita a interação entre AKT e ?-actina no núcleo e seus possíveis impactos no controle da regulação gênica em células de melanoma.
A serina/treonina quinase AKT/PKB é uma das principais proteínas de sinalização envolvidas na regulação de diferentes processos celulares como proliferação, sobrevivência, motilidade, metabolismo e diferenciação. A desregulação da atividade de AKT tem sido associada na patogênese de diversas doenças, incluindo cânceres como melanoma. Apesar do seu papel fisiológico bem definido no citoplasma, onde vários dos seus substratos são encontrados, diversas evidências mostram que AKT também migra para o núcleo em diversos tipos celulares. Assim, as funções de AKT podem ocorrer em compartimentos celulares distintos, proporcionando especificidade espacial na mediação dos seus efeitos biológicos. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos que regulam a localização e transporte de AKT para o núcleo, com quais proteínas interage e como influencia nas funções nucleares. Neste trabalho caracterizamos a presença de AKT no núcleo de duas linhagens celulares de melanoma humano que apresentam perfis genéticos distintos (A2058, PTEN deletado; Mewo PTEN selvagem), bem como investigamos proteínas nucleares alvos de interação com AKT. Nossos resultados revelaram a presença de AKT endógeno no núcleo de ambas as linhagens de melanoma e análises do perfil de AKT fosforilado no seu resíduo de serina473 mostraram que a fosforilação de AKT não é necessária para sua localização nuclear. Por meio de experimentos de co-imunoprecipitação combinada com crosslinking químico e espectrometria de massas LC-MS/MS identificamos diversas proteínas putativas que interagem com o AKT nuclear. Dentre essas, proteínas com função no splicing de mRNA, proteínas ribossomais, ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas (hnRNP) e proteínas do citoesqueleto como a ?-actina. A interação entre AKT e ?-actina foi confirmada por ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência confocal. Além disso, nossos resultados também mostram evidências que proteínas como cofilina e RNA polimerase II, conhecidas por interagir com a ?-actina nuclear, também colocalizam com o AKT no núcleo. Considerando o papel da ?-actina nuclear na regulação de importantes processos nucleares como remodelagem da cromatina, transcrição, exportação e processamento de mRNA, nosso estudo demonstra de forma inédita a interação entre AKT e ?-actina no núcleo e seus possíveis impactos no controle da regulação gênica em células de melanoma.
Descrição
Citação
COA, Larissa Leggieri. Caracterização da presença de akt no núcleo de células de melanoma e identificação de proteínas associadas por espectrometria de massas. 2016. 82 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Diadema, 2016.