Papel imunoregulador das microvesículas derivadas de células-tronco mesenquimais na polarização de macrófagos
Data
2015-05-31
Autores
Agudelo, Juan Sebastian Henao 
Orientadores
Silva Filho, Alvaro Pacheco e Silva Filho
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Introdução: Os macrófagos (M?s) são células heterogêneas que contribuem para a doença renal e/ou na regeneração renal. Os M?s M1 secretam citocinas pró-inflamatórias e ROS que amplificam a resposta inflamatória e exacerbam a lesão renal. Contrariamente, os M?s M2 liberam moléculas antiinflamatórias e fatores de crescimento que atenuam a inflamação e promovem a regeneração renal. Nesse sentido, a geração de macrófagos regulatórios no parênquima renal, se converte numa importante ferramenta para estabelecer terapias alternativas no contexto da doença renal crônica e aguda. Interessantemente, as células-tronco mesenquimais (CTMs) tem um potencial imunomodularorio confirmado sobre varias células do sistema imune. Nos M?s, as CTMs tem mostrado ser efetivas para educa-los e reprogramá-los a M?s M1 em M?s M2 através da secreção parácrina de TSG-6 e PGE2. Tem-se demonstrado que a secreção de fatores bioativos no meio extracelular é tal vez o principal mecanismo pela qual acontece a modulação macrofágica. Somado a isso, tem-se demostrado recentemente que CTMs tem a capacidade de secretar microvesículas com funções renoprotetor e imunomoduladoras similares a da célula. Porém, o efeito fisiológico das microvesículas derivadas de CTMs (MVs-CTMs) sobre os M?s permanece ainda desconhecido, e dado que a modulação macrofágica representa um enfoque promissor e atual da proteção renal, nos propusemos como objetivo principal: avaliar o papel imunoregulador das microvesículas (MVs) derivadas de CTMs sobre os M?s. Métodos: M?s murinos derivados de medula óssea previamente ativados para fenótipo M1 (24h LPS/INF-g) foram co-cultivados com CTMs ou MVs-CTMs por 48 horas. No tratamento com CTMs se emprego uma proporção 1:1 (CTMs- M?s), e na intervenção com as MVs-CTMs foram dadas doses de 50 µg cada 8 horas. Complementarmente, o efeito das MVs-CTMs sobre M?s residentes, foi avaliado num modelo in vivo de peritonites estéril por solução de tioglicolato a 3% em camundongos machos C57BL/6. Os experimentos foram executados após de prévia caraterização e polarização de M?s medulares, diferenciação de CTMs, análises de MVs-CTMS e padronização do modelo de tioglicolato. Resultados: Inicialmente nós caracterizamos e verificamos a capacidade dos M?s derivados de medula óssea para ativar-se em M?s M1 ou M?s M2. Posteriormente, constatamos que a co-cultura de CTMs com M?s M1 gerava redução de marcadores M1 como CD86 e CCR7 e aumenta a expressão de CD206 (M2). Complementarmente, o tratamento de M?s M1 com MVs-CTMs mostrou-se ser efetivo para diminuir moléculas pró-inflamatórias como CCR7, IL-1-?, IL-6 e NO e eficiente para promover um perfil regulatório nos M?s tratados, evento evidenciado pelo incremento de IL-10, CD206, e atividade enzimática da arginase. Posteriormente, nos estudamos o perfil dos miRNAs associados com a polarização macrofágica para entender o mecanismo pelo qual estaria acontecendo a modulação. O miR-155, um miR associado com produção de citocinas pró-inflamatórias, resultou surpreendentemente menos expresso nos M?s tratados com MVs. Do mesmo modo, SOCS3 uma molécula alvo do miR-155 com um alto potencial imunoregulador , estava incrementada nos M?s expostos a Mvs. Este mecanismo explicaria finalmente a redução de moléculas inflamatórias e aumento de moléculas M2 nos M?s tratados. Por outro lado, nos confirmamos por NanoSight que as MVs-CTMs apresentavam um tamanho médio de 75 nm e expressavam em sua superfície marcadores clássicos de CTMs como CD105, CD90, CD44 e CD73. O potencial terapêutico in vivo das MVs-CTMs sobre macrófagos residentes foi comprovado num modelo de peritonites estéril. Primariamente, nos observamos que os camundongos tratados com 4 doses de MVs (100µg/24h) tinham uma redução significativa no numero de células reclutadas na cavidade peritoneal. De igual modo, M?s residentes (F4/80+CD11b+) presentes no lavado desses animais se encontravam em menor proporção que nos animais controles, e expressavam menos INOS e CD86. Curiosamente, as MVs-CTMs aumentaram na cavidade peritoneal o recrutamento de células mielóide e definida como (F4/80+CD11b-). Esta célula com características aparentemente regulatórias mostrou uma exuberante expressão de CD206 e quase nenhuma expressão de TLR4 e CD86. Por fim, o microambiente antiinflamatório gerado pelas MVs-CTMs foi confirmado quando se observou que as citocinas IFN-?,IL-?,IL-1? e TNF-??presentes no lavado peritoneal se encontravam quantitativamente reduzidas nos animais tratados. Conclusão: Nossos resultados sugerem que as MVs-CTMS são efetivas tanto in vitro como in vivo para modular e transformar macrófagos M1 para um perfil mais regulador (M1-derivado MVs-CTMs). Dita modulação, foi confirmada no modelo de peritonites estéril por tioglicolato. Onde M?s residentes que se encontravam diminuídos em numero também expressavam redução de marcadores M1 nos animais tratados. Adicionalmente, acreditamos que o mecanismo pelo qual acontece a modulação possa estar associado com a redução do miR-155 que leva ao aumento da expressão de SOCS3 e diminuição de citocinas pró-inflamatórias, assim com aumento de marcadores M2.
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AGUDELO, Juan Sebastian Henao. Papel imunoregulador das microvesículas derivadas de células-tronco mesenquimais na polarização de macrófagos. 2015. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.