Desenvolvimento de PCR em tempo real para detecção rápida de Escherichia coli diarreiogênica

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dc.contributor.advisorScaletsky, Isabel Cristina Affonso [UNIFESP]
dc.contributor.authorSouza, Tamara Barros de [UNIFESP]
dc.date.accessioned2015-12-06T23:45:40Z
dc.date.available2015-12-06T23:45:40Z
dc.date.issued2012
dc.description.abstractIntrodução: no Brasil, as Escherichia coli ainda estao entre as causas mais importantes de diarreia aguda particularmente em criancas. Com os conhecimentos biologicos, clinicos e epidemiologicos mais aprofundados, foram estabelecidos seis patotipos diferentes de E. coli diarreiogenica (DEC): E. coli enteropatogenica (EPEC), E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora de toxinas de Shiga (STEC) ou E. coli enterohemorragica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC). A identificacao dos diferentes patotipos representa um desafio, pois o uso de apenas testes bioquimicos e provas sorologicas nao sao suficientes na deteccao de alguns patotipos. Objetivo: avaliar o desempenho da tecnica da PCR em tempo real para o diagnostico de infeccoes por DEC visando a sua utilizacao na rotina laboratorial. Resultados: inicialmente, foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real para a deteccao simultanea dos seis patotipos de DEC, e subdivisao de EPEC em tipica e atipica, utilizando o sistema de deteccao SYBR®Green. Este ensaio utiliza nove conjuntos de primers especificos para as sequencias geneticas: eae e pEAF de EPEC, aatA de EAEC, afaBC de DAEC, elt e est de ETEC, ipaH de EIEC e stx1 e stx2 de STEC em uma unica reacao. Posteriormente um segundo ensaio foi desenvolvido para deteccao dos patotipos mais frequentes em nosso meio, EPEC, EAEC e DAEC. Neste ensaio foi escolhido o sistema de deteccao TaqMan® e quatro conjuntos de primers/sondas para detectar a presenca das sequencias geneticas eae e pEAF de EPEC, aatA de EAEC e afaBC de DAEC. Em seguida, a especificidade dos ensaios foi avaliada em amostras comprovadas de DEC, amostras de E. coli nao patogenicas e amostras de outras enterobacterias. Todas as amostras de DEC e de Shigella spp. emitiram sinal de fluorescencia forte e positivo. A sensibilidade foi determinada com as amostras prototipo, e o limite de deteccao foi de aproximadamente 102UFC/mL; em amostras de fezes nao diarreicas inoculadas com diferentes concentracoes de amostras prototipo de DEC, os limites de deteccao variaram de 2,5x107 a 4,5x105UFC/ml por grama de fezes nos ensaios de PCR TaqMan® e PCR SYBR®Green. A aplicacao das PCRs em tempo real foi realizada em amostras de E. coli isoladas das fezes de 97 criancas Quilombolas com diarreia e 285 criancas controle do Espirito Santo, e os resultados comparados com os de PCR convencional e hibridizacao de colonias. Houve total concordancia entre os resultados obtidos com ambos os ensaios, entretanto a PCR SYBR®Green detectou 52 amostras a mais que a PCR convencional e a PCR TaqMan® detectou 96 a mais que a hibridizacao de colonias mas nao identificou 7 amostras. O calculo de coeficiente de Kappa mostrou forte correlacao (0,81) entre a PCR SYBR®Green e a PCR convencional e boa correlacao (0,61) entre a PCR TaqMan® e o teste de hibridizacao de colonias. Conclusao: nossos ensaios de PCR em tempo real oferecem possibilidade de uma rapida e sensivel identificacao simultanea dos diferentes patotipos de DEC, podendo ser utilizados em laboratorios clinicos e de pesquisapt
dc.description.sourceBV UNIFESP: Teses e dissertações
dc.format.extent106 p.
dc.identifier.citationSão Paulo: [s.n.], 2012. 106 p.
dc.identifier.fileepm-3011410305561.pdf
dc.identifier.urihttp://repositorio.unifesp.br/handle/11600/22328
dc.language.isopor
dc.publisherUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/restrictedAccess
dc.subjectCriançapt
dc.subjectEscherichia colipt
dc.subjectReação em Cadeia da Polimerase em Tempo Realpt
dc.subjectChilden
dc.subjectEscherichia colien
dc.subjectReal-Time Polymerase Chain Reactionen
dc.titleDesenvolvimento de PCR em tempo real para detecção rápida de Escherichia coli diarreiogênicapt
dc.title.alternativeDevelopment of real-time PCR for rapid detection of diarrheagenic Escherichia colien
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis
unifesp.campusSão Paulo, Escola Paulista de Medicina (EPM)pt
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