Clonagem, expressao da heparanase-1 humana e desenvolvimento de novo metodo para determinacao da atividade enzimatica
Data
2013
Autores
Melo, Carina Mucciolo 
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Heparanase e uma endo-β-glucuronidase que possui duas isoformas: a heparanase-1 (HPSE) e a heparanase-2 (HPSE2). A HPSE tem atividade catalitica, ja a HPSE2 tem somente a funcao de regulacao. A HPSE, apos traducao tem 65 kDa na sua forma latente, sofre processamento proteolitico formando tres fragmentos, um de 50 kDa, e outros dois de 8 kDa e 6 kDa. Em mamiferos, a HPSE torna-se ativa apos a formacao de um heterodimero com os residuos de 50 kDa e 8 kDa. A superexpressao da HPSE ja foi descrita em processos inflamatorios e em carcinomas humanos com baixa taxa de sobrevida dos pacientes. Com a enzima recombinante ativa sera possivel investigar a HPSE, o que podera contribuir com o entendimento dos processos celulares que relacionam a expressao da HPSE com o desenvolvimento de tumores e processos inflamatorios. Pelos motivos apresentados, os objetivos do presente estudo foram clonagem, expressao da HPSE recombinante e desenvolvimento de novo metodo para determinacao da atividade enzimatica da HPSE. O cDNA da HPSE foi obtido de linhagem celular de cancer de mama (MCF-7). Apos sequenciamento, o fragmento de cDNA referente a fracao ativa da HPSE (50 kDa) foi clonado no vetor de expressao pGEX-2TK e transformado em E.coli BL21(DE3). A cultura de bacterias com vetor plasmidial recombinante, foi adicionado oÆisopropil-β-D-1-tiolgalactopiranosideo para inducao da expressao da HPSE recombinante. Apos lise celular do extrato bruto de bacterias, foi feita purificacao com coluna de cromatografia por afinidade. Foi realizado ensaio de atividade usando heparam sulfato biotinilado com a amostra da HPSE recombinante purificada e como controle foi utilizado extrato celular de cancer de mama metastatico (SKBR3). Verificou-se que a HPSE recombinante e ativa, porem a HPSE recombinante parece clivar menor quantidade de heparam sulfato quando comparado ao extrato celular de SKBR3, isso se deve provavelmente, a nao formacao do heterodimero na HPSE recombinante. Foi observado que o metodo de heparam biotinilado sofria interferencias quando usado com extrato bruto de bacterias. Portanto, foi desenvolvido um novo metodo de atividade enzimatica para determinacao da atividade da HPSE em extrato bruto de bacterias e nao so na amostra ja purificada. O novo metodo proposto e baseado no aumento de fluorescencia do reagente resazurin a 590 nm quando reduzido pela hidroxila anomerica do substrato fondaparinux. A hidroxila anomerica e gerada somente apos diGestão do substrato com a HPSE ativa. Este metodo mostrou-se sensivel a diferentes atividades enzimaticas da HPSE e a fluorescencia do reagente resazurin foi diretamente proporcional a quantidade de hidroxilas redutoras geradas pela atividade catalitica da HPSE. Comite de etica em pesquisa da Universidade Federal de São Paulo: 724462
Descrição
Citação
MELO, Carina Mucciolo. Clonagem, expressão da heparanase1 humana e desenvolvimento de novo método para determinação da atividade enzimática. 2013. 61f. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo. São Paulo, 2013.