Identificacao molecular e analise filogenetica das especies do complexo Candida parapsilosis utilizando genes mitocondriais
Data
2012
Autores
Souza, Ana Carolina Remondi 
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Candida parapsilosis e a segunda especie de Candida mais frequentemente isolada de infeccoes de corrente sanguinea na America do Sul e em alguns paises europeus, como a Espanha e a Italia. Desde 2005, essa especie tem sido considerada um complexo de tres especies proximas: C. parapsilosis (sensu stricto), Candida metapsilosis e Candida orthopsilosis. Nesse trabalho descrevemos um ensaio para a identificacao dessas especies baseado na tecnologia de TaqMan de PCR em tempo real utilizando DNA mitocondrial (mtDNA) como alvo. Inicialmente, utilizamos ferramentas da genomica comparativa para localizar regioes sintenicas entre genomas mitocondriais das tres especies e, entao, selecionamos o gene NADH5 como alvo para a PCR e para as inferencias filogeneticas. As sondas foram desenhadas baseadas em uma combinacao de diferentes polimorfismos de unica base (SNPs) capazes de diferenciar cada especie do complexo C. parapsilosis. A metodologia proposta foi testada, em estudo piloto, em 4 cepas referencia e 5 isolados clinicos utilizando, primeiramente, mtDNA como template e em seguida, DNA genomico. Para validacao, usamos um total de 100 isolados clinicos de C. parapsilosis (sensu lato), incluindo: 66 cepas originarias de diferentes regioes geograficas do Brasil, 30 isolados provenientes da Espanha utilizados como braco cego do estudo e 4 cepas da American Type Culture Collection (ATCC). Alem disso, foram utilizados como controle negativo, 6 cepas de especies nao pertencentes ao complexo C. parapsilosis. A partir de DNA genomico a PCR em tempo real foi capaz de diferenciar as 3 especies com 100% de acuracia, nao sendo observada amplificacao quando DNA de outras especies foi usado como template. Alem disso, o metodo apresentou 100% de concordancia com as identificacoes geradas pelo sequenciamento da regiao ITS. Em relacao a divergencia evolutiva das especies do complexo C. parapsilosis nos sequenciamos uma porcao do gene NADH5 de 18 isolados e as sequencias geradas foram utilizadas para a construcao das arvores filogeneticas. Estas apontaram que, para o gene NADH5, C. metapsilosis se caracteriza como a especie basal e, portanto, pode-se sugerir que esta seja a especie progenitora. As analises de entropia mostraram que o gene NADH5 e conservado e parece estar sob acao da deriva genetica, sendo este o fenomeno responsavel pelo processo de especiacao que as especies C. parapsilosis (sensu stricto), C. orthopsilosis e C. metapsilosis estao passando. Alem disso, embora nossos dados apontem que a especie C. metapsilosis seja a especie ancestral, os valores de entropia e teste de selecao obtidos bem como estudos filogeneticos previos da literatura mostram que a divergencia evolutiva das 3 especies pertencentes ao complexo nao e possivel de ser avaliada uma vez que elas podem ser resultado de uma politomia real (hard politomy). Nosso trabalho e o primeiro a descrever um metodo molecular baseado no sistema TaqMan de PCR em tempo real, utilizando o gene mitocondrial NADH5, para a identificacao rapida e acurada das tres especies do complexo C. parapsilosis. Alem de conomizar tempo, quando comparado com o sequenciamento, a metodologia proposta constitui uma ferramenta valiosa para estudos clinicos e epidemiologicos sobre estas especies emergentes
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Citação
São Paulo: [s.n.], 2012. 147 p.