Captura de anticorpos monoclonais anti-IgG humana a partir de sobrenadante de cultura celular por precipitação com polietilenoglicol e cloreto de zinco

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dc.contributor.advisorBresolin, Igor Tadeu Lazzarotto [UNIFESP]
dc.contributor.advisor-coBresolin, Iara Rocha Antunes Pereira [UNIFESP]
dc.contributor.advisor-coLatteshttp://lattes.cnpq.br/5925807286464060pt_BR
dc.contributor.advisorLatteshttp://lattes.cnpq.br/5750111176589237pt_BR
dc.contributor.authorPássaro, Ana Carolina Moreno [UNIFESP]
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/1973730368476455pt_BR
dc.coverage.spatialDiademapt_BR
dc.date.accessioned2023-03-23T16:12:09Z
dc.date.available2023-03-23T16:12:09Z
dc.date.issued2023-02-24
dc.description.abstractOs anticorpos monoclonais (mAbs) são biomoléculas que se tornaram fundamentais em diversas áreas de estudo, sendo capazes de reconhecer analitos em uma mistura complexa e, desta forma, contribuir em dispositivos de detecção e diagnóstico médico, como os testes imunodiagnósticos rápidos. Estes testes utilizam, como um de seus reagentes de captura, anticorpos do tipo anti-IgG humana que atuam no processo de detecção de IgG policlonal no sangue de indivíduos humanos. Neste sentido, este trabalho teve como finalidade estudar a técnica de precipitação com polietilenoglicol (PEG) e ZnCl2 como alternativa não-cromatográfica de captura para mAbs de aplicações não-terapêuticas, porém que ainda requerem alto grau de pureza, tal como os utilizados em testes imunodiagnósticos. Os experimentos foram conduzidos utilizando PEG de diferentes massas moleculares e concentrações (4000 e 6000 g mol-1, variando de 0 a 16% m/v) e ZnCl2 (0 a 16 mmol L-1) como agentes precipitantes para mAbs IgG1 de camundongo do tipo anti-IgG humana provenientes de sobrenadante de cultura celular de hibridomas, determinando-se suas curvas de solubilidade e as condições mais promissoras para precipitação em batelada, além de otimizar a etapa de ressuspensão e realizar uma análise de viscosidade para os anticorpos ressuspensos. A concentração de anticorpos foi avaliada por cromatografia de afinidade analítica com proteína A imobilizada em matriz sólida e em eluição gradiente em HPLC (High Performance Liquid Chromatography), estimando-se a pureza dos precipitados por cromatografia por exclusão de tamanho em eluição isocrática, também em HPLC. Os experimentos resultaram na obtenção de um precipitado com rendimento de 100% e pureza de 15% (obtido por precipitação com PEG6000 14%) e de um precipitado de 100% de rendimento e 59% de pureza (obtido por precipitação com PEG6000 12% combinado com ZnCl2 3 mmol L-1). A análise de viscosidade indicou que a combinação de PEG6000 e ZnCl2 como agentes precipitantes não permitiu uma redução da viscosidade dinâmica do sobrenadante de precipitação (5,96 mPa s) quando comparado ao sobrenadante obtido com apenas PEG6000 (5,71 mPa s), embora tenha resultado em um precipitado com viscosidade menor (2,41 mPa s) que a do sobrenadante. Visto que a pureza máxima obtida foi de cerca de 60%, para que os mAbs se tornem elegíveis para a aplicação mencionada (pureza mínima de 98%), recomenda-se a complementação com outro método de purificação, bem como a possibilidade do uso de pré-operações de concentração do material de partida.pt_BR
dc.description.abstractMonoclonal antibodies (mAbs) are biomolecules that have become fundamental in several areas of study, being able to recognize analytes in a complex mixture and, therefore, contribute to the development of detection and medical diagnostic devices, such as rapid serological tests. These tests utilize anti-human IgG antibodies that work as capture reagents during the detection of polyclonal IgG in human blood. Therefore, this paper aimed to study the precipitation technique with polyethylene glycol (PEG) and zinc chloride as a non-chromatographic capture alternative for non-therapeutic application mAbs that still require high purity levels, such as the ones used in serological tests. Experiments were carried out using PEG of different molecular weights and concentrations (4000 and 6000 g mol-1, ranging from 0 to 16% m/v) and ZnCl2 (0 to 16 mmol L-1) as potential precipitating agents to purify anti-human IgG mice IgG1 mAbs out of cell culture supernatant produced by hybridomas, determining its solubility curves and the most promising conditions for batch precipitation, also optimizing the resuspension step and performing a viscosity analysis for the resolubilized antibodies. Antibodies concentration was evaluated through analytical affinity chromatography with protein A immobilized onto a solid matrix and in gradient elution on HPLC (High Performance Liquid Chromatography), whereas precipitates’ purity was estimated by size exclusion chromatography in isocratic elution, also on HPLC. Experiments resulted in a precipitate with 100% yield and 15% purity (obtained by precipitation with 14% PEG6000) and a precipitate with 100% yield and 59% purity (obtained by precipitation with 12% PEG6000 combined with 3 mmol L-1 ZnCl2). Viscosity analysis indicated that the combination of PEG6000 and ZnCl2 as precipitating agents did not lead to a reduction of the precipitation supernatant’s dynamic viscosity (5.96 mPa s) compared to the supernatant obtained with just PEG6000 (5.71 mPa s), although it resulted in a precipitate with lower viscosity (2.41 mPa s). Given that the highest purity value achieved was close to 60%, in order to make the mAbs eligible for the aforementioned application (purity of at least 98%), the use of additional purification methods or pre-concentration techniques are recommended.pt_BR
dc.description.sponsorshipFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)pt_BR
dc.description.sponsorshipIDFAPESP: 2020/12552-1pt_BR
dc.description.sponsorshipIDFAPESP: 2022/02807-8pt_BR
dc.emailadvisor.custombresolin@unifesp.brpt_BR
dc.format.extent97 f.pt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.unifesp.br/handle/11600/67294
dc.languageporpt_BR
dc.publisherUniversidade Federal de São Paulopt_BR
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccesspt_BR
dc.subjectAnticorpos monoclonaispt_BR
dc.subjectPurificaçãopt_BR
dc.subjectPrecipitaçãopt_BR
dc.subjectPEGpt_BR
dc.subjectZincopt_BR
dc.subjectMonoclonal antibodiespt_BR
dc.subjectPurificationpt_BR
dc.subjectPrecipitationpt_BR
dc.subjectZincpt_BR
dc.titleCaptura de anticorpos monoclonais anti-IgG humana a partir de sobrenadante de cultura celular por precipitação com polietilenoglicol e cloreto de zincopt_BR
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/masterThesispt_BR
unifesp.campusInstituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas (ICAQF)pt_BR
unifesp.graduateProgramEngenharia Químicapt_BR
unifesp.researchAreaTecnologia Química, Bioquímica e de Materiaispt_BR
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