Caracterização de Aspergillus spp. no cenário clínico brasileiro, modelos experimentais de aspergilose invasiva e avaliação farmacológica dos novos compostos F901318 e APX001A
Data
2017-12-11
Autores
Negri, Clara Ezequiel 
Orientadores
Colombo, Arnaldo Lopes
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Aspergillus is a mould genus frequently isolated in cases of fungal infections among patients at tertiary hospitals worldwide. Currently, the genus is composed of about 350 species, being more than 40 already described as a human pathogen in diverse clinical syndromes. In general, A. fumigatus is the most prevalent species causing invasive aspergillosis (IA) in Brazil and worldwide. The Brazilian scenario regarding cryptic and rare Aspergillus species presenting intrinsical resistance to antifungal drugs, as well as A.fumigatus resistance to triazoles is not known. Due antifungal resistance reported in some countries, multiple drug-drug interactions and considerable toxicity of Amphotericin B, new compounds, with new therapeutical targets are urgently required. In addition, there is also interest for experimental models standardization that allows the determination of pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD) parameters associating efficiency of the drug in different therapeutic regimens. Therefore the articles presented in the present study aims to characterize Aspergillus species distribution and susceptibility profile in the Brazilian clinical scenario, verify the presence of acquired triazole resistance, developed new experimental IA models applied to analyses of therapeutic response and evaluate PD of two new compounds, F901318 (F2G Ltd) and the active moiety APX001A (APX001 pro-drug) (Amplyx Ltd) using a diversity of IA experimental models. Article 1: The purpose of this study was to analyse the distribution of cryptic and rare Aspergillus species among clinical samples from 133 patients admitted in 12 medical centres in Brazil and to analyse the in vitro activity of different antifungal drugs. The identification of Aspergillus species was performed based on a polyphasic approach, as well as sequencing analysis of the ITS region, calmodulin and β-tubulin genes and phylogenetic analysis when necessary. The in vitro susceptibility tests with voriconazole, posaconazole and itraconazole were performed according to the CLSI M38-A2 document (2008). We were able to demonstrate a high prevalence of cryptic species (19%) causing human infection, and three isolates represented by species A. thermomutatus, A. ochraceus and A. calidoustus showed less in vitro susceptibility to at least one of the triazoles tested. Article 2: Here we evaluated the in vitro antifungal susceptibility of 221 clinical A. fumigatus isolate, from 6 medical centres in Brazil according to CLSI M38 A-2 guidelines. Sixty-one isolates (27%) exhibiting MIC xix at the epidemiological cut-off value (ECV) for itraconazole or above ECV for any triazole were checked for CYP51A mutations. No mutations were documented, indicating that triazoles may be safely used to treat aspergillosis in Brazil. Article 3: F901318 (F2G Ltd) is the leading representative of a novel class of drug, the orotomides, is an antifungal drug in clinical development. Novel experimental in vitro (static and dynamic) and in vivo (murine) models of sinopulmonary infections caused by A. flavus were developed to evaluate F901318 PD using galactomannan (GM) and histopathology as models’ readout. Mathematical models were used to correlate F901318 exposure-response. All novel experimental models demonstrated to be an efficient tool for pharmacological analyses of antifungal drugs. F901318 is a potential new agent for the treatment of invasive infections caused by Aspergillus flavus with PDs that are comparable to other first-line triazole agents. Article 4: APX001A (Amplyx Ltd) is the active moiety of the new compound APX001, with action in the fungus cell wall. The pharmacodynamic of APX001A was analysed according to EUCAST susceptibility tests and in a static in vitro model of IPA caused by an A. fumigatus wild-type strain as well as strains carrying mutations related to triazole resistance. Galactomannan index (GMI) was used as PD readout. The Minimal effective concentration of 0.03 mg/L was obtained for all isolates and the concentration-dependent decline was observed in a static model, which ≤ 0.5 mg/L caused near maximal GMI suppression in the endothelial compartment of the static model for all isolates tested, showing a potential use of APX001 for IPA treatment.
Aspergillus é um gênero de fungos filamentosos frequentemente isolado em casos de infecções fúngicas invasivas em hospitais terciários no mundo. O gênero é constituído atualmente por cerca de 350 espécies, sendo mais de 40 já descritas como patógenos humanos, em diversas síndromes clínicas. A. fumigatus é, em geral, a espécie mais prevalente em casos de aspergilose invasiva (AI), no Brasil e no mundo. O cenário brasileiro em relação a espécies crípticas ou raras de Aspegillus que apresentem resistência intrínseca e em relação a isolados de A. fumigatus resistentes a triazólicos não é conhecido. Dada a emergência de resistência a antifúngicos reportada em diversos países, diversas interações medicamentosas com outros fármacos e toxicidade considerável a anfotericina B, novos fármacos, com novos alvos terapêuticos, são urgentemente requeridos. Da mesma forma, há interesse na padronização de modelos que possibilitem determinar parâmetros de farmacocinética (PK) e farmacodinâmica (PD) associados a maior eficiência no tratamento, utilizando diferentes regimes terapêuticos. Sendo assim, os artigos aqui apresentados visam caracterizar a distribuição de espécies e perfil de susceptibilidade de Aspergillus spp. no cenário clínico brasileiro, verificar a existência de resistência adquirida a triazólicos, bem como desenvolver modelos experimentais de AI aplicados a análise de resposta terapêutica e por fim, avaliar PD dos novos compostos F901318 e da forma ativa APX001A do pró-fármaco APX001 em diversos modelos experimentais de AI. Artigo científico 1: Este estudo teve como objetivo avaliar a distribuição de espécies crípticas e raras de Aspergillus spp e a susceptibilidade in vitro a triazólicos em 133 isolados clínicos provenientes de 12 centros médicos brasileiros. A identificação de espécies foi realizada aplicando abordagem polifásica, incluindo caracterização morfológica, sequenciamento da região ITS, genes calmodulina e β-tubulina e análises filogenéticas, quando necessário. Testes de susceptibilidade in vitro foram realizados de acordo com o documento CLSI M38-A2 (2008). Demonstramos alta prevalência de espécies crípticas (19%), e três isolados representantes das espécies A. thermomutatus, A. ochraceus and A. calidoustus que apresentaram susceptibilidade reduzida frente aos triazólicos. Artigo científico 2: Neste estudo avaliamos a susceptibilidade in vitro de 221 isolados clínicos de A. fumigatus provenientes de 6 centros médicos brasileiros, de acordo com o documento CLSI M38-A2 (2008). Identificou-se 61 (27%) com valores de CIMs iguais ao de cut-off epidemiológico (VCE) frente a itraconazol e/ou acima do VCE frente a qualquer triazólico testado. Nenhuma mutação no gene CYP51A, relacionada a resistência a triazólicos foi encontrada, demonstrado que o uso de triazólicos no tratamento de aspergilose no Brasil ainda parece ser seguro. Artigo científico 3: F901318 (F2G Ltd) é um novo fármaco em desenvolvimento pertencente a nova classe terapêutica dos orotomides. Novos modelos experimentais de infecção sinopulmonar causada por A. flavus in vitro (modelos estático e dinâmico) e in vivo (modelo murino) foram desenvolvidos para avaliar a PD de F901318, utilizando galactomanana (GM) como biomarcador de resposta terapêutica. Modelos matemáticos foram utilizados para correlacionar a exposiçãoresposta ao composto. Os novos modelos experimentais demonstraram eficácia na avaliação farmacológica de antifúngicos. F901318 demonstrou importante efeito antifúngico em todos os modelos, com resultados no mínimo equivalentes aos de antifúngicos comumente utilizados. Artigo científico 4: APX001A (Amplyx Ltd) é a forma ativa do novo pró-fármaco APX001, representante de nova classe antifúngica que atua na parede celular da célula fúngica. A PD de APX001A foi avaliada através de testes de susceptibilidade in vitro de acordo com EUCAST e também utilizando modelo estático in vitro de aspergilose pulmonar invasiva causada por isolado de A. fumigatus (isolados sensível e outros sabidamente resistentes a triazólicos), GM foi utilizada como biomarcador de resposta terapêutica. A concentração efetiva mínima (CEM) de 0,03 mg/L foi obtida para todos os isolados nos testes de susceptibilidade. Houve supressão quase máxima de GM no compartimento endotelial do modelo estático quando exposto a 0,5 mg/L de APX001A em todos os isolados testados. Foi demonstrada atividade do composto frente a A. fumigatus, incluindo isolados sabidamente resistentes a outras classes terapêuticas, evidenciando potencial uso de APX001A no tratamento de AI.
Aspergillus é um gênero de fungos filamentosos frequentemente isolado em casos de infecções fúngicas invasivas em hospitais terciários no mundo. O gênero é constituído atualmente por cerca de 350 espécies, sendo mais de 40 já descritas como patógenos humanos, em diversas síndromes clínicas. A. fumigatus é, em geral, a espécie mais prevalente em casos de aspergilose invasiva (AI), no Brasil e no mundo. O cenário brasileiro em relação a espécies crípticas ou raras de Aspegillus que apresentem resistência intrínseca e em relação a isolados de A. fumigatus resistentes a triazólicos não é conhecido. Dada a emergência de resistência a antifúngicos reportada em diversos países, diversas interações medicamentosas com outros fármacos e toxicidade considerável a anfotericina B, novos fármacos, com novos alvos terapêuticos, são urgentemente requeridos. Da mesma forma, há interesse na padronização de modelos que possibilitem determinar parâmetros de farmacocinética (PK) e farmacodinâmica (PD) associados a maior eficiência no tratamento, utilizando diferentes regimes terapêuticos. Sendo assim, os artigos aqui apresentados visam caracterizar a distribuição de espécies e perfil de susceptibilidade de Aspergillus spp. no cenário clínico brasileiro, verificar a existência de resistência adquirida a triazólicos, bem como desenvolver modelos experimentais de AI aplicados a análise de resposta terapêutica e por fim, avaliar PD dos novos compostos F901318 e da forma ativa APX001A do pró-fármaco APX001 em diversos modelos experimentais de AI. Artigo científico 1: Este estudo teve como objetivo avaliar a distribuição de espécies crípticas e raras de Aspergillus spp e a susceptibilidade in vitro a triazólicos em 133 isolados clínicos provenientes de 12 centros médicos brasileiros. A identificação de espécies foi realizada aplicando abordagem polifásica, incluindo caracterização morfológica, sequenciamento da região ITS, genes calmodulina e β-tubulina e análises filogenéticas, quando necessário. Testes de susceptibilidade in vitro foram realizados de acordo com o documento CLSI M38-A2 (2008). Demonstramos alta prevalência de espécies crípticas (19%), e três isolados representantes das espécies A. thermomutatus, A. ochraceus and A. calidoustus que apresentaram susceptibilidade reduzida frente aos triazólicos. Artigo científico 2: Neste estudo avaliamos a susceptibilidade in vitro de 221 isolados clínicos de A. fumigatus provenientes de 6 centros médicos brasileiros, de acordo com o documento CLSI M38-A2 (2008). Identificou-se 61 (27%) com valores de CIMs iguais ao de cut-off epidemiológico (VCE) frente a itraconazol e/ou acima do VCE frente a qualquer triazólico testado. Nenhuma mutação no gene CYP51A, relacionada a resistência a triazólicos foi encontrada, demonstrado que o uso de triazólicos no tratamento de aspergilose no Brasil ainda parece ser seguro. Artigo científico 3: F901318 (F2G Ltd) é um novo fármaco em desenvolvimento pertencente a nova classe terapêutica dos orotomides. Novos modelos experimentais de infecção sinopulmonar causada por A. flavus in vitro (modelos estático e dinâmico) e in vivo (modelo murino) foram desenvolvidos para avaliar a PD de F901318, utilizando galactomanana (GM) como biomarcador de resposta terapêutica. Modelos matemáticos foram utilizados para correlacionar a exposiçãoresposta ao composto. Os novos modelos experimentais demonstraram eficácia na avaliação farmacológica de antifúngicos. F901318 demonstrou importante efeito antifúngico em todos os modelos, com resultados no mínimo equivalentes aos de antifúngicos comumente utilizados. Artigo científico 4: APX001A (Amplyx Ltd) é a forma ativa do novo pró-fármaco APX001, representante de nova classe antifúngica que atua na parede celular da célula fúngica. A PD de APX001A foi avaliada através de testes de susceptibilidade in vitro de acordo com EUCAST e também utilizando modelo estático in vitro de aspergilose pulmonar invasiva causada por isolado de A. fumigatus (isolados sensível e outros sabidamente resistentes a triazólicos), GM foi utilizada como biomarcador de resposta terapêutica. A concentração efetiva mínima (CEM) de 0,03 mg/L foi obtida para todos os isolados nos testes de susceptibilidade. Houve supressão quase máxima de GM no compartimento endotelial do modelo estático quando exposto a 0,5 mg/L de APX001A em todos os isolados testados. Foi demonstrada atividade do composto frente a A. fumigatus, incluindo isolados sabidamente resistentes a outras classes terapêuticas, evidenciando potencial uso de APX001A no tratamento de AI.