NAADP: um novo segundo mensageiro mobilizador de Ca2+ regulador da autofagia
Data
2015-04-30
Autores
Pereira, Gustavo José da Silva 
Orientadores
Smaili, Soraya Soubhi
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
O ácido nicotínico adenina dinucleotídeo fosfato (NAADP) tem sido reportado como um importante mobilizador de Ca2+ intracelular, porém seu modo de ação e seu papel na autofagia ainda estão sob discussão. Estudos mais recentes mostraram que as proteínas da família dos canais Two-Pore Channels (TPCs) podem estar em membranas endolisossomais atuando como possíveis receptores do NAADP. Além disso, mostrou-se que o neurotransmissor glutamato é um agonista dos receptores do NAADP pois apresentou potencial liberativo de Ca2+ dos lisossomos e foi capaz de aumentar os níveis citosólicos de NAADP. Sendo a autofagia uma via de degradação dependente dos lisossomos, o objetivo do nosso trabalho foi estudar a sinalização de Ca2+ mediada pelo NAADP e a sua correlação com a via autofágica regulada por ele e pelo glutamato. No presente trabalho, foi mostrado que NAADP ativa os canais TPCs localizados em membranas endolisossomais, principalmente a isoforma TPC2. A interação de NAADP com os TPCs levou à liberação de Ca2+ estocado em organelas ácidas, que foi bloqueada pelo antagonista de seus receptores, Ned-19. O NAADP-AM, análogo permeante do NAADP, (1 µM e 100 nM) e o glutamato (10 µM) regularam a autofagia, uma vez que os níveis de LC3II foram dependentes do tempo e potencializados pelos tratamentos com inibidores lisossomais (E64d/Pepstatina A). No entanto, Ned-19 (1 µM) não foi capaz de promover um acúmulo de LC3II após o tratamento com E64d/Pepstatina A. Além disso, o NAADP-AM, o Ned-19 e o glutamato induziram o aumento do número de pontuações de LC3 em vermelho (autolisossomos). Adicionalmente, demonstrou-se que o NAADP-AM e o glutamato modularam a autofagia independentemente da mTOR, via sinalização Ca2+/AMPK/ACC, enquanto o Ned-19 inibiu a via autofágica no estágio final, a degradação. O Ned-19, por si só, induziu o acúmulo de LC3II, e foi capaz de bloquear a formação de LC3II mediada pelo glutamato, sendo acompanhado pela inibição da via da AMPK. Pelo fato dos receptores TPCs serem canais sensíveis ao NAADP localizados nos lisossomos, os seus efeitos foram examinados sob ativação do NAADP-AM ou glutamato na formação de autofagossomos em células superexpressando TPC1 ou TPC2. Assim, o NAADP-AM e o glutamato, de fato, induziram o acúmulo de LC3II em células TPC1 ou TPC2, o que não foi evidenciado para o p62. A fim de confirmar essa regulação dos TPCs na via autofágica, o fluxo autofágico foi estudado em astrócitos ou em células SHSY5Y silenciadas para cada uma da isoforma TPC. Esses silenciamentos foram capazes de diminuir a formação de LC3II induzidas tanto pelo NAADP como pelo glutamato, e evitou a elevação da expressão de p62. Portanto, nossos dados demonstraram que a ativação da sinalização NAADP/TPCs/Ca2+ modula a autofagia induzida pelo glutamato em duas etapas da autofagia, a primeira, na formação do LC3, seguido de degradação de p62. Essas evidências sugerem que as vias de sinalização do NAADP e glutamato na autofagia contribuirão para a compreensão dos mecanismos mediados pelo recrutamento de estoques de Ca2+ sensíveis ao NAADP pelo glutamato sugerindo um possível papel fisiológico da sinalização NAADP/TPCs no sistema nervoso central.
Autophagy is an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. We showed the Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) as a potent Ca2+ mobilizing messenger in astrocytes, since NAADP releases Ca2+ from the endo-lysosomal system and this effect was mediated by the two-pore channels (TPCs), especially TPC type 2. Some independent studies have been shown that the specificity of NAADP-mediated Ca2+ release is inhibited by Ned-19. Furthermore, glutamate has been considered as a potential NAADP-agonist in neuronal and glial cells. But, whether and how NAADP, Ned-19 or glutamate act in astrocytes is unclear and the functions on autophagy pathway have yet to be defined. In our present work, the effects of NAADP (cell permeant-NAADP, NAADP-AM), Ned-19 and glutamate and their relationship between on autophagy regulation were studied. We showed that NAADP (1 uM and 100 nM) and glutamate (10 uM) induced autophagy, since increased LC3-II levels in a time dependent-manner and were potentiated by lysosomal inhibitors (E64d/Pepstatin A) treatment. However, Ned-19 (1 uM) didn't cause a further induced LC3-II accumulation after E64d/Pepstatin A treatment. Additionally, we found that NAADP and glutamate activate autophagy mTOR independent via ACC/AMPK pathway whereas Ned-19 inhibits these autophagic vias. Interestingly, Ned-19 on its own was effect on LC3II formation, but could block the increase in LC3II formation glutamate-mediated. This was accompanied largely by a reversal in the glutamate-mediated changes on AMPK activity, but was not able to modulate mTOR downstream proteins. Because TPCs might be NAADPsensitive Ca2+-permeable channel in lysosomes, we examined the effects of NAADP-AM or glutamate on the fate of autophagosomes or p62 in TPC1 or 2- overexpressing cells. NAADP-AM and the glutamate indeed further induced the accumulation of LC3II in TPC1 cells. On the other hand, treatment with glutamate decreased the levels of LC3II and p62 levels in TPC2- overexpressing cells. Moreover, glutamate and NAADP, but also Ned-19 increased the red LC3 puncta (autolysosomes) in wild-type astrocytes cells.
Autophagy is an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. We showed the Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) as a potent Ca2+ mobilizing messenger in astrocytes, since NAADP releases Ca2+ from the endo-lysosomal system and this effect was mediated by the two-pore channels (TPCs), especially TPC type 2. Some independent studies have been shown that the specificity of NAADP-mediated Ca2+ release is inhibited by Ned-19. Furthermore, glutamate has been considered as a potential NAADP-agonist in neuronal and glial cells. But, whether and how NAADP, Ned-19 or glutamate act in astrocytes is unclear and the functions on autophagy pathway have yet to be defined. In our present work, the effects of NAADP (cell permeant-NAADP, NAADP-AM), Ned-19 and glutamate and their relationship between on autophagy regulation were studied. We showed that NAADP (1 uM and 100 nM) and glutamate (10 uM) induced autophagy, since increased LC3-II levels in a time dependent-manner and were potentiated by lysosomal inhibitors (E64d/Pepstatin A) treatment. However, Ned-19 (1 uM) didn't cause a further induced LC3-II accumulation after E64d/Pepstatin A treatment. Additionally, we found that NAADP and glutamate activate autophagy mTOR independent via ACC/AMPK pathway whereas Ned-19 inhibits these autophagic vias. Interestingly, Ned-19 on its own was effect on LC3II formation, but could block the increase in LC3II formation glutamate-mediated. This was accompanied largely by a reversal in the glutamate-mediated changes on AMPK activity, but was not able to modulate mTOR downstream proteins. Because TPCs might be NAADPsensitive Ca2+-permeable channel in lysosomes, we examined the effects of NAADP-AM or glutamate on the fate of autophagosomes or p62 in TPC1 or 2- overexpressing cells. NAADP-AM and the glutamate indeed further induced the accumulation of LC3II in TPC1 cells. On the other hand, treatment with glutamate decreased the levels of LC3II and p62 levels in TPC2- overexpressing cells. Moreover, glutamate and NAADP, but also Ned-19 increased the red LC3 puncta (autolysosomes) in wild-type astrocytes cells.
Descrição
Citação
PEREIRA, Gustavo Jose da Silva. NAAPD: um novo segundo mensageiro mobilizador de Ca2+ regulador da autofagia. 2015. 208 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.