Desenvolvimento de nanopartículas magnéticas de sílica mesoporosa como vetores não virais em magnetofecção
Data
2020-05-15
Autores
Francisco, Giorgio Fernando De Avelar 
Orientadores
Bizeto, Marcos Augusto
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Gene therapy is based on introduction of exogenous genetic material into the cells aiming the treatment of genetic diseases from the inactivation/substitutions of defective genes or by the introduction of genes which can express therapeutic proteins. Incompetent recombination virus based vectors are the most utilized at this transfer, but instead of the high efficiency, there are many risks associated to the possibility of the expression of remaining viral genes, promoting intense immunologic response and generation of competent replication virus by recombination which can promote oncogenesis. Thence, the development of non-viral vectors, mainly based on inorganic nanoparticles has become an interesting technological and scientific topic. The transfection process is complex, and many cell barriers must be transposed by the vector. The cell entry, generally, occurs by endocytosis, which requires ideals charge and size. After passing through cell membrane, the vector is imprisoned in cell compartments which interior has acidic medium and rich in nucleases that degrade the genetic material. Nucleic acids released at cytosol in this stage can be transferred to the cell nucleus, passing through the nucleus membrane where it will be transcript. In this work, capacity (or efficiency) of magnetofection was evaluated in order to improve the rate of cell uptake by endocytosis of vectors based in mesoporous silica nanoparticles. The magnetofection process consists in cell transfection with magnetic nanoparticles by applying an external magnetic field. Initially, it was synthesized different types of mesoporous silica nanoparticles combined with superparamagnetic nucleus of magnetite (Fe3O4), which were chemically modified with propyldiethylenotriamine to enable the conjugation with molecules of plasmid DNA responsible to promote the expression of green fluorescent protein (GFP) in HeLa cells. Among the as-prepared magnetic vectors, just one of them presented propitious characteristics to transfection study. This vector was prepared by hydrolysis of silica inorganic precursor using sodium hydroxide as catalyst around magnetic nanoparticles in the presence of micelle aggregates of surfactant hexadecyltrimethylammonium bromide, to shape the formation of silica wall pores. The as-prepared nanomaterial infrared spectrum presented the main bands of the vibrational modes of magnetite, silica and propyldiethylenotriamine group. The N2 physissortion isotherms showed an improvement on the surface area of 14 m2 /g to 254 m2 /g after the covering, with an isotherm of type IV, which is characteristic of mesoporous material. The X ray diffractometry identified the presence of magnetite as a crystal at face centered cubic form and the amorphous silica. The transmission electron microscopy showed an agglomerate of spherical particles with a well defined core-shell structure. The colloidal stability of the propyldiethylenotriamine modified nanoparticles was evaluated in dispersion made in sodium chloride solution by zeta potential (26 ± 1mV) and by determination of hydrodynamic size (516 ± 74nm) by dynamic light scattering. Finally, the magnetofection of HeLa cells with the as-prepared magnetic nanoparticles showed a higher transfection rate (5.4 ± 3.2%) when compared to the control groups presenting a good perspective of its use in gene therapy.
A terapia gênica é baseada na introdução de material genético exógeno em células alvo visando o tratamento de doenças, a partir da inativação/substituição de genes defeituosos, ou pela introdução de genes para expressar proteínas terapêuticas. Vetores à base de vírus de replicação incompetente são os mais utilizados nesta transferência, mas apesar da alta eficiência, há vários riscos associados à possibilidade de expressão de genes virais remanescentes que podem desencadear reações imunológicas intensas e geração de vírus de replicação-competente por recombinações que pode provocar oncogênese. Por essa razão, o desenvolvimento de vetores não virais, principalmente os vetores baseados em nanopartículas inorgânicas tornou-se um tópico de grande interesse científico e tecnológico. A transfecção é um processo complexo e várias barreiras celulares devem ser transpostas pelo vetor. A entrada do vetor na célula geralmente ocorre por endocitose, o que exige que o vetor tenha carga e tamanho ideais. Ultrapassada a membrana celular, o vetor é aprisionado em compartimentos celulares cujo interior possui meio ácido e é rico em nucleases, que degradam o material genético. Os ácidos nucleicos liberados no citosol desta etapa podem ser transferidos ao núcleo, passando pela barreira da membrana nuclear e serem transcritos no núcleo. Neste estudo, capacidade (ou eficiência) de magnetofecção foi avaliada visando melhorar a taxa de captação celular por endocitose de vetores à base das nanopartículas de sílica mesoporosa. A magnetofecção consiste na transfecção celular com nanopartículas magnéticas aplicando um campo magnético externo. Inicialmente, foram sintetizadas diferentes tipos de nanopartículas de sílica mesoporosa combinadas a núcleos superparamagnéticos de magnetita (Fe3O4), as quais foram quimicamente modificadas com grupos propildietilenotriamina para possibilitar a conjugação com moléculas de DNA plasmidial responsáveis por promover a expressão da proteína verde fluorescente (GFP) em células HeLa. Dentre os vetores magnéticos preparados, apenas um deles apresentou características propicias para os estudos de transfecção. Este vetor foi preparado pela hidrólise do precursor inorgânico de sílica usando hidróxido de sódio como catalisador ao redor de núcleos das nanopartículas magnéticas na presença de agregados micelares do surfactante brometo de hexadeciltrimetilamônio para moldar a formação dos poros nas paredes de sílica. O espectro vibracional do nanomaterial preparado apresentou as principais bandas dos modos vibracionais da magnetita, sílica e grupo propiletilenotriamina. As isotermas de fisissorção de N2 mostraram um aumento na área superficial de 14 m2 /g para 254 m2 /g após o recobrimento, e uma isoterma do tipo IV que é característica de material mesoporoso. A difratometria de raios X mostrou a presença de magnetita com retículo cúbico de face centrada e da estrutura amorfa de sílica. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou um aglomerado de partículas esféricas com arranjo do tipo core-shell bem definido. A estabilidade coloidal das nanopartículas modificadas com os grupos propildietilenotriamina foi avaliada em dispersão produzida em solução de cloreto de sódio pela determinação do potencial zeta (26 ± 1 mV) e pela determinação do tamanho hidrodinâmico (516 ± 74 nm) por espalhamento dinâmico de luz. Finalmente, a magnetofecção de células HeLa com as nanopartículas magnéticas produzidas mostrou uma taxa de transferência gênica bem superior (5,4 ± 3,2%) em relação aos grupos de controles, mostrando uma boa perspectiva de seu uso para terapia gênica.
A terapia gênica é baseada na introdução de material genético exógeno em células alvo visando o tratamento de doenças, a partir da inativação/substituição de genes defeituosos, ou pela introdução de genes para expressar proteínas terapêuticas. Vetores à base de vírus de replicação incompetente são os mais utilizados nesta transferência, mas apesar da alta eficiência, há vários riscos associados à possibilidade de expressão de genes virais remanescentes que podem desencadear reações imunológicas intensas e geração de vírus de replicação-competente por recombinações que pode provocar oncogênese. Por essa razão, o desenvolvimento de vetores não virais, principalmente os vetores baseados em nanopartículas inorgânicas tornou-se um tópico de grande interesse científico e tecnológico. A transfecção é um processo complexo e várias barreiras celulares devem ser transpostas pelo vetor. A entrada do vetor na célula geralmente ocorre por endocitose, o que exige que o vetor tenha carga e tamanho ideais. Ultrapassada a membrana celular, o vetor é aprisionado em compartimentos celulares cujo interior possui meio ácido e é rico em nucleases, que degradam o material genético. Os ácidos nucleicos liberados no citosol desta etapa podem ser transferidos ao núcleo, passando pela barreira da membrana nuclear e serem transcritos no núcleo. Neste estudo, capacidade (ou eficiência) de magnetofecção foi avaliada visando melhorar a taxa de captação celular por endocitose de vetores à base das nanopartículas de sílica mesoporosa. A magnetofecção consiste na transfecção celular com nanopartículas magnéticas aplicando um campo magnético externo. Inicialmente, foram sintetizadas diferentes tipos de nanopartículas de sílica mesoporosa combinadas a núcleos superparamagnéticos de magnetita (Fe3O4), as quais foram quimicamente modificadas com grupos propildietilenotriamina para possibilitar a conjugação com moléculas de DNA plasmidial responsáveis por promover a expressão da proteína verde fluorescente (GFP) em células HeLa. Dentre os vetores magnéticos preparados, apenas um deles apresentou características propicias para os estudos de transfecção. Este vetor foi preparado pela hidrólise do precursor inorgânico de sílica usando hidróxido de sódio como catalisador ao redor de núcleos das nanopartículas magnéticas na presença de agregados micelares do surfactante brometo de hexadeciltrimetilamônio para moldar a formação dos poros nas paredes de sílica. O espectro vibracional do nanomaterial preparado apresentou as principais bandas dos modos vibracionais da magnetita, sílica e grupo propiletilenotriamina. As isotermas de fisissorção de N2 mostraram um aumento na área superficial de 14 m2 /g para 254 m2 /g após o recobrimento, e uma isoterma do tipo IV que é característica de material mesoporoso. A difratometria de raios X mostrou a presença de magnetita com retículo cúbico de face centrada e da estrutura amorfa de sílica. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou um aglomerado de partículas esféricas com arranjo do tipo core-shell bem definido. A estabilidade coloidal das nanopartículas modificadas com os grupos propildietilenotriamina foi avaliada em dispersão produzida em solução de cloreto de sódio pela determinação do potencial zeta (26 ± 1 mV) e pela determinação do tamanho hidrodinâmico (516 ± 74 nm) por espalhamento dinâmico de luz. Finalmente, a magnetofecção de células HeLa com as nanopartículas magnéticas produzidas mostrou uma taxa de transferência gênica bem superior (5,4 ± 3,2%) em relação aos grupos de controles, mostrando uma boa perspectiva de seu uso para terapia gênica.