Avaliação da atividade anti-angiogênica do secretoma de Aspergillus fumigatus e de drogas antifúngicas
Data
2016-12-14
Autores
Xafranski, Hemílio 
Orientadores
Colombo, Arnaldo Lopes
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: Aspergillus fumigatus is the most commonly isolated agent causing aspergillosis. Invasive pulmonary aspergillosis (IA) is an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised patients. Chronic cavitary pulmonary aspergillosis (CCPA) affects immunocompromised patients with previous pulmonary lesion. Angiogenesis is an important physiological response to both clinical presentations of aspergillosis. Thus, patients presenting IA develop necrosis and tissue hypoxia, indicating angiogenesis inhibition at the infected lung region, meanwhile CCPA patients develop major hemoptysis, indicating that angiogenesis is not inhibited at the infection site. Fungi, specially Aspergillus sp., can produce a wide array of secondary metabolites, as well as molecules of pharmaceutical and biotechnological interest. In this context, the study of angiogenesis modulating molecules produced by A. fumigatus is promising to deepen the understanding of aspergillosis pathogenesis and to prospect new molecules with pharmacological potential. Objectives: The objective of this study was to evaluate the angiogenesis modulation by the secretome of A. fumigatus clinical isolates and antifungal drugs used in the treatment of pulmonary aspergillosis. Methods: Five A. fumigatus isolates from IA and CCPA patients were selected for secretome harvesting, anti-angiogenic activity evaluation, and secretome separation into fractions and sub-fractions, aiming to identify anti-angiogenic secretome fractions. Three pilot methods for the growth and harvest of A. fumigatus secretome were standardized and the secretomes obtained by the most suitable method (pilot 3) were analysed by LC-MS. The angiogenesis modulation activity of the secretomes was evaluated in RAEC cell culture, through capillary-like formation assays using Geltrex®. The most active secretome was separated into fractions and sub-fractions which were tested for anti-angiogenic activity. Additionally, the angiogenesis modulation by antifungal drugs was evaluated through RAEC cell proliferation, migration and capillary-like tube formation assays. Results: We successfully standardized three reproducible methods for the production of A. fumigatus secretome. From the 3 tested methods, the pilot 3 method was the most suitable for the prospection of new biologically active molecules. Despite the low number of isolates, we observed that secretomes from IA isolates mostly inhibited angiogenesis, while the secretomes from CCPA did not inhibited angiogenesis. Using this methodology we could successfully isolate an A. fumigatus secretome fraction bearing anti-angiogenic activity and not containing gliotoxin or fumagillin, fungi produced molecules previously described to present anti-angiogenic activity. We also observed inhibition of capillary-like structures, migration and proliferation in RAEC by the antifungal drug itraconazole and inhibition of proliferation in RAEC by the antifungal drug posaconazole. Our findings highlight the potential of the investigation of molecules secreted by Aspergillus fumigatus to contribute to the understanding of the pathogenesis of aspergillosis and to isolate new biologically active molecules.
Introdução: Aspergillus fumigatus é o agente etiológico mais isolado em aspergilose. A aspergilose pulmonar invasiva (AI) é uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunocomprometidos enquanto aspergilose pulmonar crônico cavitária (ACC) acomete pacientes imunocompetentes com lesão pulmonar previa. A angiogênese é uma importante resposta fisiológica a estas duas formas clínicas de aspergilose. Desta maneira, os pacientes com AI desenvolvem necrose e hipóxia tecidual indicando uma inibição da angiogênese na área pulmonar afetada, enquanto os pacientes com ACC desenvolvem hemoptise importante indicando que a angiogênese não encontra-se inibida no sítio da infecção. Os fungos, particularmente A. fumigatus, produzem uma ampla variedade de metabólitos secundários e moléculas de interesse biotecnológico e farmacêutico. Neste contexto, é promissor o estudo de moléculas moduladoras da angiogênese produzidas por A. fumigatus visando o melhor entendimento da patogênese de aspergilose e a prospecção de moléculas com potencial farmacológico. Objetivos: O presente estudo tem como objetivo avaliar a modulação da atividade angiogênica pelo secretoma de amostras clínicas de Aspergillus fumigatus e de drogas comumente utilizadas no tratamento de aspergilose invasiva. Métodos: Foram selecionados 5 isolados de A. fumigatus provenientes de pacientes diagnosticados com AI e ACC para a obtenção do secretoma, avaliação da atividade anti-angiogênica, fracionamento e subfracionamento do secretoma, visando identificar frações do secretoma com atividade anti-angiogênica. Três métodos piloto de cultivo e obtenção do secretoma de A. fumigatus foram padronizados e os secretomas obtidos pelo método que se mostrou mais adequado (piloto 3) foram analisados por LC-MS. A capacidade destes secretomas de inibir a angiogênese foi avaliada em cultura de células RAEC por meio de ensaios de formação de tubo capilar em Geltrex®. O secretoma com atividade mais evidente de inibição da angiogênese foi submetido a fracionamento e subfracionamento com avaliação da atividade anti-angiogênica das frações geradas. Adicionalmente, a modulação da angiogênese por drogas antifúngicas foi avaliada em células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) por ensaios de proliferação, migração e formação de tubos capilares. Resultados: Obtivemos sucesso na padronização de três metodologias reprodutíveis para a obtenção do secretoma de A. fumigatus. Para a prospecção de moléculas com atividade biológica o método piloto 3 mostrou-se o mais adequado. Apesar do baixo número de isolados incluídos, verificou-se a atividade anti-angiogênica dos secretomas de isolados de AI, que não foi verificada em isolados de ACC. Com esta metodologia obtivemos sucesso no isolamento de uma fração do secretoma de A. fumigatus com atividade anti-angiogênica e que não contém gliotoxina ou fumagilina, moléculas produzidas por fungos cuja atividade anti-angiogênica já foi descrita. Verificou-se a inibição da formação de tubos capilares, migração e proliferação de RAEC na presença de itraconazol e inibição da proliferação de RAEC na presença de posaconazol. Nossos achados destacam o potencial da investigação das moléculas secretadas por A. fumigatus para contribuir à compreensão da patogênese de aspergilose e ao isolamento de novas moléculas com atividade biológica.
Introdução: Aspergillus fumigatus é o agente etiológico mais isolado em aspergilose. A aspergilose pulmonar invasiva (AI) é uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunocomprometidos enquanto aspergilose pulmonar crônico cavitária (ACC) acomete pacientes imunocompetentes com lesão pulmonar previa. A angiogênese é uma importante resposta fisiológica a estas duas formas clínicas de aspergilose. Desta maneira, os pacientes com AI desenvolvem necrose e hipóxia tecidual indicando uma inibição da angiogênese na área pulmonar afetada, enquanto os pacientes com ACC desenvolvem hemoptise importante indicando que a angiogênese não encontra-se inibida no sítio da infecção. Os fungos, particularmente A. fumigatus, produzem uma ampla variedade de metabólitos secundários e moléculas de interesse biotecnológico e farmacêutico. Neste contexto, é promissor o estudo de moléculas moduladoras da angiogênese produzidas por A. fumigatus visando o melhor entendimento da patogênese de aspergilose e a prospecção de moléculas com potencial farmacológico. Objetivos: O presente estudo tem como objetivo avaliar a modulação da atividade angiogênica pelo secretoma de amostras clínicas de Aspergillus fumigatus e de drogas comumente utilizadas no tratamento de aspergilose invasiva. Métodos: Foram selecionados 5 isolados de A. fumigatus provenientes de pacientes diagnosticados com AI e ACC para a obtenção do secretoma, avaliação da atividade anti-angiogênica, fracionamento e subfracionamento do secretoma, visando identificar frações do secretoma com atividade anti-angiogênica. Três métodos piloto de cultivo e obtenção do secretoma de A. fumigatus foram padronizados e os secretomas obtidos pelo método que se mostrou mais adequado (piloto 3) foram analisados por LC-MS. A capacidade destes secretomas de inibir a angiogênese foi avaliada em cultura de células RAEC por meio de ensaios de formação de tubo capilar em Geltrex®. O secretoma com atividade mais evidente de inibição da angiogênese foi submetido a fracionamento e subfracionamento com avaliação da atividade anti-angiogênica das frações geradas. Adicionalmente, a modulação da angiogênese por drogas antifúngicas foi avaliada em células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) por ensaios de proliferação, migração e formação de tubos capilares. Resultados: Obtivemos sucesso na padronização de três metodologias reprodutíveis para a obtenção do secretoma de A. fumigatus. Para a prospecção de moléculas com atividade biológica o método piloto 3 mostrou-se o mais adequado. Apesar do baixo número de isolados incluídos, verificou-se a atividade anti-angiogênica dos secretomas de isolados de AI, que não foi verificada em isolados de ACC. Com esta metodologia obtivemos sucesso no isolamento de uma fração do secretoma de A. fumigatus com atividade anti-angiogênica e que não contém gliotoxina ou fumagilina, moléculas produzidas por fungos cuja atividade anti-angiogênica já foi descrita. Verificou-se a inibição da formação de tubos capilares, migração e proliferação de RAEC na presença de itraconazol e inibição da proliferação de RAEC na presença de posaconazol. Nossos achados destacam o potencial da investigação das moléculas secretadas por A. fumigatus para contribuir à compreensão da patogênese de aspergilose e ao isolamento de novas moléculas com atividade biológica.
Descrição
Citação
XAFRANSKI, Hemilio. Avaliação da atividade anti-angiogênica do secretoma de Aspergillus fumigatus e de drogas antifúngicas. 2016. 96 f. Tese (Doutorado em Infectologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.