Comparação dos efeitos de célulastronco e de suas vesículas extracelulares no tratamento de lesão renal induzida por estenose crônica da artéria renal
Data
2018-06-29
Autores
Silva, Crysthiane Saveriano Rubiao 
Orientadores
Boim, Mirian Aparecida
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Chronic renal artery stenosis is considered one of the most frequent causes of
renovascular hypertension (RH), which can lead to irreversible renal tissue damage
and deterioration of renal function. In this project we used the experimental model of
partial stenosis of the renal artery known as 2 kidneys 1
clip model (2K1C)
to
induce RH and chronic renal hypoxia. Faced with limited treatment alternatives and
reduced angiogenic and regenerative ability of the kidneys, stem cells appear as a
promising alternative therapy for chronic renal ischemia. Previous studies have
shown that mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from bone marrow have
produced significant beneficial effects on the 2K1C
model through paracrine effects,
stimulating angiogenesis and immunomodulation. Recent evidence indicates that
MSC conditioned medium containing extracellular vesicles (EV), including
microvesicles (MV) and exosomes (EX) released by MSC have therapeutic effects
similar to MSCs. Therefore, the aim of this study was to investigate and compare the
effects of MSC obtained from adipose tissue and MV and EX on tissue regeneration
in the 2K1C
model. Methods: MSCs were obtained from white adipose tissue (ASC)
of Wistar rats and were characterized according to their immunophenotype and
multipotentiality. Extracellular vesicles (EV) were isolated from the ASC culture
medium and sizeseparated
in MV and EX by ultracentrifugation. Vesicles were
identified by nanoparticles tracking using Nanosight and analyzed by the presence of
specific markers for each type of EV by western blotting. Male Wistar rats were
divided into five groups: 1Sham
Group; 2Stenotic
Group; 3Stenotic
Group +
ASCs; 4Stenotic
Group + MV; 5Stenotic
Group + EX. The ASC, MV and EX were
infused through the tail vein at the 3rd and 5th weeks after clamping. Systolic blood
pressure (SBP) was monitored weekly. After six weeks, 24hour
urine and blood
were collected for biochemical analyzes. Kidneys were removed for molecular
biology analysis. Gene expression was verified by quantitative realtime
PCR and
analyzed using the following markers: Collagen type I (Col I), TGFβ, HIF1α
SDF1α,
IL1β
and IL10
in the renal cortex and medulla. Results: Flow cytometry analysis showed that after 48 hours the ASCs were retained mainly in the stenotic and
contralateral kidneys followed by lungs and heart. After 15 days the presence of ASC
decreased significantly in the lungs but was still present in both kidneys. The stenotic
animals showed a progressive increase in SBP while the groups treated with ASC,
MV and EX showed a stabilization of PAS in similar degrees between the different
treatments. Plasma creatinine was similar between groups, however, the stenotic
animals developed proteinuria which was reduced by treatment with ASC and MV an
effect not observed in the EX treated group. There was an increase in the expression
of Col I and TGFβ in the stenotic and contralateral kidney (cortex and medulla) which
was reduced by the treatment with ASC, MV and EX. ASCtreated
animals showed a
significant increase in expression of the stem cells homing marker (SDF1α)
in the
cortex and medulla in the stenotic and contralateral kidney, the MV and EX treated
groups also showed an smaller increase in the expression of SDF1α
in both kidneys.
The hypoxia marker (HIF1α)
presented an increase in the stenotic kidney and the
treatments with ASC, MV and EX were efficient in reducing this marker. There was
an increase of the proinflammatory
cytokine IL1β
in both kidneys of the
hypertensive animals being efficiently reduced in both kidneys mainly by the ASC
treated group and the treatments with ASCs, MV and EX was able to induce an
increase the antiinflammatory
cytokine IL10.
In conclusion, the results suggest that
the EV released by ASC produced good results, but with lower efficiency in some
parameters when compared to ASC. The use of ASCs has produced more effective
effects in this model of chronic hypoxia and the use of EV in replacement to cells
should be evaluated depending on the parameter to be corrected.
A estenose crônica da artéria renal é considerada uma das causas mais frequentes de hipertensão renovascular (HR) podendo levar a injúria irreversível do tecido renal e deterioração da função renal. Neste projeto utilizamos o modelo experimental de estenose parcial da artéria renal conhecida como modelo 2 rins 1 clipe (2R1C) para induzir HR e hipóxia renal crônica. Diante das alternativas limitadas de tratamentos e a reduzida habilidade angiogênica e regenerativa dos rins, as célulastronco surgem como uma alternativa promissora de terapia para lesão renal pósisquemia crônica. Estudos prévios mostraram que célulastronco mesenquimais (MSC) obtidas de medula óssea produziram significantes benefícios no modelo 2R1C através de efeitos parácrinos, estimulando a angiogênese e a imunomodulação. Evidências recentes indicam que o meio condicionado de MSC contendo vesículas extracelulares (VE), incluindo as microvesículas (MV) e os exossomos (EX) têm efeitos terapêuticos semelhantes às próprias MSC. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar e comparar os efeitos das MSC obtidas de tecido adiposo e suas MV e EX na regeneração tecidual no modelo 2R1C. Metodologia: As MSC foram obtidas do tecido adiposo branco (ASC) de ratos Wistar e foram caracterizadas de acordo com o seu imunofenótipo e multipotencialidade. As vesículas extracelulares (VE) foram isoladas do meio de cultura das ASC e separadas, de acordo com o tamanho, em MV e EX por ultracentrifugação. As vesículas foram identificadas por rastreamento de nanopartículas (Nanosight) e analisadas pela presença de marcadores específicos para cada tipo de VE por western blotting. Ratos Wistar machos foram divididos em cinco grupos: 1Grupo Sham; 2Grupo Estenótico; 3Grupo Estenótico + ASCs; 4Grupo Estenótico + MV; 5Grupo Estenótico + EX. As ASC, MV e EX foram infundidas através da veia caudal na 3ª e 5ª semanas após o clampeamento da artéria renal esquerda. A pressão arterial sistólica (PAS) foi acompanhada semanalmente. Após seis semanas foram coletados urina de 24 horas e sangue para as análises bioquímicas. Os rins foram retirados para análise de biologia molecular. A expressão gênica foi verificada por PCR quantitativo em tempo real analisando os seguintes marcadores: Colágeno I (Col I), TGFβ, HIF1α SDF1α, IL1β e IL10 no córtex e na medula renal. Resultados: Análise por citometria de fluxo mostrou que após 48 horas as ASCs ficaram retidas principalmente nos rins estenótico e contralateral seguido pelos pulmões e coração. Após 15 dias a presença de ASC diminuiu significantemente nos pulmões, mas ainda estavam presentes em ambos os rins. Os animais estenóticos apresentaram um aumento progressivo da PAS enquanto os grupos tratados com ASC, MV e EX apresentaram uma estabilização da PAS em graus semelhantes entre os diferentes tratamentos. A creatinina plasmática foi similar entre os grupos, entretanto, os animais estenóticos desenvolveram proteinúria a qual foi reduzida pelo tratamento com ASC e MV, mas não com EX. Houve um aumento na expressão de Col I e TGFβ no rim estenótico e contralateral (córtex e medula) o qual foi reduzido pelo tratamento com ASC, MV e EX. Os animais tratados com ASC apresentaram um aumento significante na expressão do marcador de homing de célulastronco SDF1α no córtex e medula tanto no rim estenótico quanto no rim contralateral, os grupos tratados com MV e EX também apresentaram aumento, embora menor, na expressão de SDF1α em ambos os rins. O marcador de hipóxia HIF1α apresentou aumento no rim estenótico e os tratamentos com ASC, MV e EX foram eficientes em reduzir este marcador. Houve um aumento da citocina próinflamatória IL1β em ambos os rins dos animais hipertensos sendo eficientemente reduzida nos dois rins principalmente pelo grupo tratado com ASC e os tratamentos com ASCs, MV e EX foram capazes de induzir um aumento na expressão da citocina antiinflamatória IL10. Em conclusão, os resultados sugerem que as VE liberadas por ASC produziram bons resultados, porém com menor eficiência em alguns parâmetros quando comparado às ASC. A utilização das ASC produziu efeitos mais eficazes neste modelo de hipóxia crônica comparados à MV e EX e, portanto, a utilização das VE em substituição às células deve ser avaliada na dependência do parâmetro a ser corrigido.
A estenose crônica da artéria renal é considerada uma das causas mais frequentes de hipertensão renovascular (HR) podendo levar a injúria irreversível do tecido renal e deterioração da função renal. Neste projeto utilizamos o modelo experimental de estenose parcial da artéria renal conhecida como modelo 2 rins 1 clipe (2R1C) para induzir HR e hipóxia renal crônica. Diante das alternativas limitadas de tratamentos e a reduzida habilidade angiogênica e regenerativa dos rins, as célulastronco surgem como uma alternativa promissora de terapia para lesão renal pósisquemia crônica. Estudos prévios mostraram que célulastronco mesenquimais (MSC) obtidas de medula óssea produziram significantes benefícios no modelo 2R1C através de efeitos parácrinos, estimulando a angiogênese e a imunomodulação. Evidências recentes indicam que o meio condicionado de MSC contendo vesículas extracelulares (VE), incluindo as microvesículas (MV) e os exossomos (EX) têm efeitos terapêuticos semelhantes às próprias MSC. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar e comparar os efeitos das MSC obtidas de tecido adiposo e suas MV e EX na regeneração tecidual no modelo 2R1C. Metodologia: As MSC foram obtidas do tecido adiposo branco (ASC) de ratos Wistar e foram caracterizadas de acordo com o seu imunofenótipo e multipotencialidade. As vesículas extracelulares (VE) foram isoladas do meio de cultura das ASC e separadas, de acordo com o tamanho, em MV e EX por ultracentrifugação. As vesículas foram identificadas por rastreamento de nanopartículas (Nanosight) e analisadas pela presença de marcadores específicos para cada tipo de VE por western blotting. Ratos Wistar machos foram divididos em cinco grupos: 1Grupo Sham; 2Grupo Estenótico; 3Grupo Estenótico + ASCs; 4Grupo Estenótico + MV; 5Grupo Estenótico + EX. As ASC, MV e EX foram infundidas através da veia caudal na 3ª e 5ª semanas após o clampeamento da artéria renal esquerda. A pressão arterial sistólica (PAS) foi acompanhada semanalmente. Após seis semanas foram coletados urina de 24 horas e sangue para as análises bioquímicas. Os rins foram retirados para análise de biologia molecular. A expressão gênica foi verificada por PCR quantitativo em tempo real analisando os seguintes marcadores: Colágeno I (Col I), TGFβ, HIF1α SDF1α, IL1β e IL10 no córtex e na medula renal. Resultados: Análise por citometria de fluxo mostrou que após 48 horas as ASCs ficaram retidas principalmente nos rins estenótico e contralateral seguido pelos pulmões e coração. Após 15 dias a presença de ASC diminuiu significantemente nos pulmões, mas ainda estavam presentes em ambos os rins. Os animais estenóticos apresentaram um aumento progressivo da PAS enquanto os grupos tratados com ASC, MV e EX apresentaram uma estabilização da PAS em graus semelhantes entre os diferentes tratamentos. A creatinina plasmática foi similar entre os grupos, entretanto, os animais estenóticos desenvolveram proteinúria a qual foi reduzida pelo tratamento com ASC e MV, mas não com EX. Houve um aumento na expressão de Col I e TGFβ no rim estenótico e contralateral (córtex e medula) o qual foi reduzido pelo tratamento com ASC, MV e EX. Os animais tratados com ASC apresentaram um aumento significante na expressão do marcador de homing de célulastronco SDF1α no córtex e medula tanto no rim estenótico quanto no rim contralateral, os grupos tratados com MV e EX também apresentaram aumento, embora menor, na expressão de SDF1α em ambos os rins. O marcador de hipóxia HIF1α apresentou aumento no rim estenótico e os tratamentos com ASC, MV e EX foram eficientes em reduzir este marcador. Houve um aumento da citocina próinflamatória IL1β em ambos os rins dos animais hipertensos sendo eficientemente reduzida nos dois rins principalmente pelo grupo tratado com ASC e os tratamentos com ASCs, MV e EX foram capazes de induzir um aumento na expressão da citocina antiinflamatória IL10. Em conclusão, os resultados sugerem que as VE liberadas por ASC produziram bons resultados, porém com menor eficiência em alguns parâmetros quando comparado às ASC. A utilização das ASC produziu efeitos mais eficazes neste modelo de hipóxia crônica comparados à MV e EX e, portanto, a utilização das VE em substituição às células deve ser avaliada na dependência do parâmetro a ser corrigido.