Instituto de Ciência e Tecnologia (ICT)
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Navegando Instituto de Ciência e Tecnologia (ICT) por Orientador(es) "Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele [UNIFESP]"
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- ItemSomente MetadadadosCaracterização bioquímica da enzima antranilato fosforibosil transferase de cryptococcus neoformans(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-09-12) Chagas, Rayane Arraes Jardim [UNIFESP]; Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0625673643875019; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)The number of patients with opportunist fungal diseases, e.g. criptococosis, has increased in recent years due to the higher occurrence of immunosuppressed patients. This phenomenon can be associated, for example, to the appearance of AIDS, to the utilization of new medical practices, like immunosuppressive therapies, and to the indiscriminate use of antimicrobial drugs. Nevertheless, the number of available antifungal drugs has remained sparse, mainly due to the low availability of new targets with highly selective toxicity, since the fungal cells are similar to the human ones, both eukaryotes. The tryptophan biosynthetic pathway is absent in human beings and past studies showed a decreasing virulence in microorganisms in which mutations caused the absence of the production of this amino acid. Thus, the study of this biosynthetic pathway is important to develop new drugs with high selective toxicity against fungal diseases. The tryptophan biosynthetic pathway is composed of five enzymes, which are: anthranilate synthase, anthranilate phosphoribosyltransferase, phosphoribosyl anthranilate isomerase, indole-3-glycerol phosphate synthase, and tryptophan synthase. In the human-pathogen model Cryptococcus neoformans, the gene APRT codifies the anthranilate phosphoribosyltransferase enzyme, which, in turn, catalyzes the second step of this pathway, catalyzing the transfer of the phosphoribosyl group of phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) to anthranilate , thus forming phosphoribosyl anthranilate. Therefore, the aim of this work was to clone, to express, and to purify in a recombinant form this pathogenic organism?s enzyme and to analyze its activity through fluorescence assay. Activity of the enzyme was verified by a Michaelis-Menten kinetic. Hence, it was possible to obtain the following constants: Km = 1,3995 ?M ± 0,6 ?M for anthranilate, Km = 0,3745 mM ± 0,14 mM for PRPP, and kcat = 0,0037s-1 ± 0,0005s-1. Biochemical characterization of this enzyme will enable future chemical compounds screens to find specific inhibitors. This, in turn, will allow the development of new techniques against this opportunist pathogen, thus demonstrating the expected impact of this applied research area.
- ItemRestritoDesenho racional de antivirais: identificação de novos inibidores contra a protease do vírus do Nilo Ocidental por high-throughput screening(Universidade Federal de São Paulo, 2021-03-03) Guimarães, Marcela [UNIFESP]; Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0625673643875019; http://lattes.cnpq.br/5092979049235406O vírus do Nilo Ocidental é um vírus de RNA, com um genoma composto por 11.029 nucleotídeos, envoltos em um capsídeo interno de 35nm. Ele é mantido em um ciclo de transmissão pássaro-mosquito-pássaro, pelo qual apenas algumas espécies de mosquitos Culex conduzem a transmissão para os seres humanos: Culex pipiens, C. quinquefasciatus e C. tarsalis. O vírus é capaz de replicar e provocar patologias no cérebro através de mecanismos potenciais de neuroinvasão, que incluem a interrupção da integridade da barreira hematoencefálica por citocinas vasoativas. Os sintomas da febre do Nilo incluem febre de início abrupto, mialgia, linfadenopatia, erupções maculopapulares não pruriginosas, meningite, encefalite, poliomielite e paralisia flácida aguda. No hemisfério ocidental, o vírus se espalhou de seu local de descoberta, em 1999 na cidade de Nova York, para a costa do Pacífico em 2003 e na Argentina em 2005. No Brasil, a presença de aves migratórias provenientes da região sul dos Estados Unidos sinaliza para o risco de introdução e transmissão do vírus do Nilo Ocidental, abrindo para discussão de ocorrências dessa arbovirose. A possibilidade de estudos in silico e os grandes avanços na área de varredura experimental de inibidores propiciaram o desenvolvimento de estratégias de estudo racional de novos fármacos pela possibilidade de identificação e otimização de moléculas pequenas com capacidade de interação com o alvo molecular de interesse. A protease do vírus do Nilo Ocidental pertence à família das serino-proteases e está localizada na porção N-terminal da NS3, contendo 179 resíduos de aminoácidos em sua sequência. A NS3pro é ativa apenas em complexo com o cofator NS2b, um peptídeo de 40 resíduos de aminoácidos que promove estabilidade e integra a fenda de ligação do substrato. Sendo uma importante proteína do metabolismo viral, e não encontrada nas células do hospedeiro, torna-se interessante a sua utilização como alvo molecular. A NS2b-NS3pro foi obtida de forma recombinante através da transformação do gene em E. coli BL21 (DE3), seguida de expressão e purificação por cromatografia de afinidade. Após estabelecimento de ensaios bioquímicos, a protease foi utilizada para realização das varreduras de inibidores em placas de 384 poços, usando a biblioteca de compostos orgânicos da Spectrum Collection (MicroSource Discovery Systems), com 2320 compostos bioativos com amplo espectro de cobertura. Seguindo parâmetros pré-estabelecidos, foram obtidos 24 resultados positivos (“hits”), que posteriormente foram confirmados por ensaios de IC50.
- ItemSomente MetadadadosEstudo estrutural da endonuclease cas6 atuante no sistema de defesa imunoadaptativo crispr-cas de procarion(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-09-06) Goncalves, Giulliana Augusta Rangel [UNIFESP]; Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0625673643875019; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)The active protein in mechanisms of post-transcriptional gene silencing have been the target of several studies due to its promising applications in the field of biological sciences by specifically recognizing oligonucleotide sequences target and mediate their cleavage or repression. The Cas6 protein endonuclease belonging to the CRISPR system (regularly interspaced short clustered palindromic repeats) has recently been described in some works by recognizing a specific sequence highly conserved in prokaryotes, first mediating its cleavage and then participating in formation of a complex with other Cas proteins, culminating in the degradation of genetic material attacker by a RNA interference mechanism, conferring immunity through this system archeas and bacteria. Thus, the purpose of this work was the structural study of the Cas6 protein of T.marítima obtained by recombinant DNA technology in E. coli Rosetta (DE3) and cloned, expressed, purified and crystallized. The native and derivative crystals were subjected to tests of diffraction X-rays with resolutions up to 2.2Å being collected various data sets, where they were processed generating statistical data. Based on this data, different methods have been used to solve the protein structure: the method of molecular replacement, isomorphous replacement and anomalous dispersion. In the latter, the incorporation of a heavy metal to the protein during the step of expression was necessary. Despite the adoption of numerous attempts and different strategies, it could not resolve the structure of the endonuclease. However, it was obtained in high concentrations, and is available for future individual tests or in complex with other Cas proteins have been purified by laboratory. The structural knowledge of this protein may contribute substantially to the establishment of inhibitors scan trials and ultimately promote the development of treatmentsfor diseases caused by these organisms.
- ItemSomente MetadadadosExpressão, purificação, cristalização e análise preliminar de dados cristalográficos da proteína csm4 de thermotoga marítima(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-11-30) Villegas, Nadia Valeria Gavilan [UNIFESP]; Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0625673643875019; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Bacteria and Archaea have developed a defense system against exogenous DNA and RNA, called CRISPR (Clustered Regularly Intespaced Short Palindromic Repeats), which consists of an operon composed of regions of repetitions (repeats) identical to each other, separated by variable regions (spacers) from invading nucleic acids, along with associated proteins (Cas proteins, CRISPR associated proteins) forming an adaptive and heritable immune system. The main objective of this project was to clone, express and purify in recombinant form the Csm4 protein from T. maritima MSB8, and to characterize structurally this protein. This protein is part of a marginally studied complex of Cas ribonucleoproteins termed the Csm complex, which is involved in the targetting of exogenous DNA from bacteriophages and horizontal transfer of nucleic acids. The protein was recombinantly produced in E. coli and purified by affinity chromatography and gel filtration. After concentration, the protein was crystallized in space group P422 with unit cell a=67,5 b=67,5 c=84,8 Å. Data obtained showed that the native crystal diffracts to 2,5 Å at a wavelength of 1,458 Å. In order to solve the structure by MIR other crystals of derivatized protein with platinum and iodide diffracted up to 3,49 and 4,02 Å at wavelengths of 1,06007 and 1,54160 Å, respectively. Additionally, we incorporated selenomethionine into the protein to be able to solve the structure by the MAD (Multi-wavelength Anomalous Diffraction) methodology. These results can serve as a basis for implementing future projects of rational and experimental design of inhibitors in order to prevent the proliferation of these organisms.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Triagem virtual em sistemas neurossensoriais(Universidade Federal de São Paulo, 2022-02-11) Rodrigues, Lucélia Gomes [UNIFESP]; Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele [UNIFESP]; ttp://lattes.cnpq.br/0625673643875019; http://lattes.cnpq.br/0279554506642045Os receptores olfatórios representam uma grande parte dos receptores acoplados à proteína G (GPCRs) em mamíferos, e estão presentes em diversos tecidos além dos tecidos olfatórios. No entanto, as suas funções além do olfato, não estão esclarecidas. Para auxiliar na elucidação destas funções se faz necessário conhecer novos ligantes. Interessantemente, receptores não GPCRs podem estar associados às funções dos ORs. Este parece ser o caso da glicoproteína IV, também conhecida como CD36, esta proteína é expressa em uma ampla variedade de tecidos. Para testar a hipótese de acoplamento de CD36 com o receptor OLFR287, e desvendar suas funções. Para este fim realizamos modelagem por homologia da OLFR287, propondo dois possíveis modelos para a OLFR287, seguido de triagem virtual de uma biblioteca de 1634 compostos, reduzindo as opções para 11 opções para experimentações laboratoriais, para posteriores testes da hipótese de que o receptor CD36 é um co-receptor do OLFR287 e elucidação de suas funções.