Navegando por Palavras-chave "Células CHO"

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    Análise do mecanismo de taquifilaxia a angiotensina II em células permanentemente transfectadas com o receptor AT1
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1999) Franca, Lucimar Pereira de [UNIFESP]; Shimuta, Suma Imura [UNIFESP]
    Uma caracteristica importante na acao da Ali e a rapida dessensibilizacao que ocorre no receptor AT1em seguida a sua ativacao repetitiva. Na investigacao dos mecanismos molecular e bioquimica pelos quais a AII leva a inibicao das respostas nas celulas estimuladas pelo peptidio, procedeu-se a transfeccao do receptor AT1 recombinante em celulas CHO. Esse receptor AT1 da AII expresso permanentemente foi caracterizado realizando-se estudos de ligacao com radioligante 3H-AII. A ligacao da 3H-AII ao receptor AT1 foi especifico (Kd: 3 nM) e saturavel (Bmax: O,41 fmol/cels.) e modulado pela proteina G. Assim, a AII estimulou a hidrolise de fosfoinositidios (EC5O: O,6 n O,1 nM) que foi completamente inibida por repetidas estimulacoes com a AII, bem como, com o seu analogo Lys2AII. A AII e a Lys2AII estimularam um aumento rapido no Ca2+ livre citosolico e influxo de 45Ca2+ apos a exposicao inicial e, rapidamente induziram a dessensibilizacao dessas respostas apos sucessivas estimulacoes. Essa taquifilaxia a AII e a Lys2AII em celulas CHO-AT1 nao era sensivel a variacoes no pH do meio, em marcante contraste a atenuacao da taquifilaxia observada em musculo liso quando o pH era elevado acima do fisiologico. Alem disso outras linhagens de celulas quando transfectadas com o mesmo CDNA, induziram taquifilaxia aos dois peptidios, diferentemente das observacoes feitas em celulas contendo receptor AT1 endogeno. Esses dados sugerem que a transferencia de DNA exogeno para o meio intracelular pode acarretar alteracoes no fenotipo e ou genotipo das celulas
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    A avaliação da adesão, migração e proliferação da linhagem celular CHO=K1 frente a mutante CHO-745 deficiente na biossíntese de glicosaminoglicanos sulfatados: amostra que a integrina alfa-5beta-1 e um proteoglicano envolvido na migração celular
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2002) Franco, Celia Regina Cavichiolo [UNIFESP]; Dietrich, Carl Peter Von [UNIFESP]
    Na presente tese examinamos o papel dos proteoglicanos e glicosaminoglicanos na divisao celular: adesao e proliferacao de celulas em cultura CHO (chinese hamster ovary) e sua mutante CHO-745 que e deficiente na sintese de glicosaminoglicanos devido a falta da enzima xilosiltransferase. Usando diferentes quantidades de celulas (selvagem e mutante) pouca adesao pode ser observada na presenca de laminina e colageno tipo I. Entretanto quando fibronectina e vitronectina foram usadas como substratos houve um aumento de adesao dos dois tipos celulares. Somente a CHO selvagem mostrou adesao em funcao do tempo sobre colageno tipo IV. Estes resultados sugerem que as duas linhagens celulares possuem diferentes propriedades de adesao. Ensaios de adesao usando colageno tipo IV com celulas CHO cultivadas na presenca de xilosideo ou clorato, mostraram reducao nos niveis de adesao, confirmando a importancia dos glicosaminoglicanos neste fenomeno. Varias evidencias experimentais sugerem que os proteoglicanos de hepara sulfato estao envolvidos na adesao celular como moduladores positivos da proliferaca celular e como composto chave no processo de divisao celular. Ensaios de proliferacao e ciclo celular demonstraram que uma diminuicao das quantidades do proteoglicano nao inibem a proliferacao da mutante CHO-745 quando comparadas com a celula selvagem pois os dois tipos celulares entram na fase S ao redor das 8 horas. A inteiracoes celulas-matriz estao implicadas em uma grande variedade d funcoes. Estas inteiracoes sao principalmente mediadas por integrinas que sa receptores da superficie celular e estao aparentemente envolvidas em adesao, migracao e diferenciacao. Por exemplo, a asj3, integrina esta envolvida na migracao e adesao da celulas sobre fibronectina. Tambem neste estudo, usando marcacao radioativa com sulfato e imunoprecipitacao...(au)
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    Envolvimento do proteoglicano de heparam sulfato no processo de secreção e internalização de catepsina B
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2003) Coulson-Thomas, Yvette May [UNIFESP]; Tersariol, Ivarne Luis dos Santos [UNIFESP]
    A interacao de cisteino-peptidases lisossomais, especialmente a catepsina B, com os proteoglicanos e de grande interesse para entender a remodelacao tecidual e a progressao tumoral. A presenca de.catepsina B na membrana plasmatica resulta em dissolucao focal de proteinas da matriz extracelular e permite as celulas tumorais invadirem o tecido. O mecanismo de secrecao e insercao de catepsina B na membrana plasmatica ainda nao esta totalmente esclarecido. Dados obtidos recentemente em nosso laboratorio sugerem que o heparam sulfato presente na superficie celular possa ser um sitio importante para ligacao de cisteino-peptidases na membrana plasmatica e na membrana basal. Portanto o estudo da interacao de catepsina B com glicosaminoglicanos e de grande interesse para entender a funcao biologica desta enzima. Para tanto, foram utilizadas celulas ovarianas de hamster chines (CHO-Kl) e sua mutante (CHO-745) deficiente na enzima xilosiltransferase. A expressao de catepsina B no meio condicionado e no extrato celular foi determinada por espectrofluorometria. A identificacao e quantificacao de proteoglicanos e glicosaminoglicanos foi feita por eletroforese em gel de agarose seguido por quantificacao da radioatividade. Em ensaios de imunocitoquimica para visualizacao endogena de catepsina B, o anticorpo primario foi o anticatepsina B humana e o anticorpo secundario foi o antilgG de coelho conjugado com Alexa Fluor 488. Em ensaios de imunocitoquimica para visualizacao de catepsina B exogena, foi utilizada catepsina B conjugada com fluor (Alexa Fluor 488). A celula selvagem (CHO-Kl) apresenta secrecao de heparam sulfato que aumenta ao longo do tempo (de 0 a 8 horas) e celula mutante (CHO-745), deficiente em xilosil-transferase, praticamente nao apresenta secrecao de heparam sulfato para o meio extracelular (Fig. 12). A celula CHO-K1 apresenta uma quantidade total celular de catepsina B 25 por cento maior do que a celula CHO745. Essa diferenca tambem e manifestada em relacao ao teor de enzima ativa, a atividade especifica de catepsina B nas celulas K1 e cerca de 31 por cento maior do que o clone 745 (Fig. 9). Alem disso, a celula selvagem possui 6 vezes mais catepsina B ligada a superficie celular do que a celula mutante (Fig. 10). As duas linhagens secretam a mesma quantidade de catepsina B no meio extracelular (Fig. 11). A secrecao de catepsina B ativa na celula selvagem aumenta ao longo do tempo (de 0 a 8 horas), enquanto a celula mutante secreta catepsina B ativa apenas nas duas primeiras horas (Fig. 12). A catepsina B secretada pela celula CHO-745 e mais labil que a enzima secretada pela celula selvagem. Conforme mostrado previamente, e sabido que o heparam sulfato e capaz de estabilizar a catepsina B em pH fisiologico. Catepsina B e heparam sulfato apresentam-se colocalizados em lisossomos e na superficie celular das celulas CHO(fgs26 e 27)a(au)
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    Influência dos glicosaminoglicanos na interação das proteínas do sistema calicreína-cinina plasmático na superfície celular
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006-02-22) Melo, Kátia Regina Brasil [UNIFESP]; Motta, Guacyara da [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The kallirein-kinin system comprises low and high molecular weight kininogens (LK and HK), tissue and plasma kallikreins, and was first recognized as a plasma and tissue proteolytic system responsible for bradykinin (BK) release. The main function of kininogens has been described as precursors of BK, a peptide which is not active unless it is released from kininogens. The plasma kallikrein-kinin system is related to vascular biology and it is involved and interacts with different systems such as coagulation, fibrinolysis, complement and renin-angiotensin systems. HK is a multidomain protein with antithrombin, antiadhesive and profibrinolytic activities. Recent studies have revealed that HK free from BK (HKa) inhibits angiogenesis while BK promotes angiogenesis. In blood and vascular cells some different proteins have been described as HK binding receptors: Mac-1 integrin (aMb-2 or CD11b/CD18) on granulocytes, the receptor that binds to the globular “heads” of C1q (p33/gC1qR), cytokeratin 1 (CK1) and urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) on HUVECs, and glycoprotein Ib-IX-V and thrombospondin on platelets. More recently both heparan sulfate and chondroitin sulfate have been described as HK putative receptors. The aim of this work was to study the influence of glycosaminoglycans (GAGs) on HK binding to cell surface and lysates and its processing using two different Chinese hamster ovary cell lines, CHO-wild type (CHO-K1) and CHO-745 (mutant) which is deficient in the synthesis of proteoglycans (PGs) due to lack of activity of xylosyl transferase. Biotin-HK (b-HK) bound to CHO-K1 cell surface in Zn2+ dependent manner. The b-HK level of binding was much higher on cell surfaces comparing to lysates from both cell lines and this binding was not reversible by 20 fold molar excess of unlabeled HK at both CHO-K1 and CHO-745. At 37°C the Bmax values for both CHO-K1 and CHO-745 are very similar but the Kdap for HK binding to CHO-K1 is 4.4 times higher comparing to CHO-745 suggesting that the presence of PGs/GAGs impair HK interaction with other putative receptors on cell surface. Considering the Bmax determinations at 4°C on CHOFor K1 it is 3.0 times lower comparing to Bmax at 37°C and on CHO-745 the Bmax value at 4°C is 1.4 times lower comparing to Bmax at 37°C. The difference of Bmax values at both temperatures for each cell line suggests that HK is internalized and confocal microscopy experiments detected HK internalized only on CHO-K1. Plasma prekallikrein (PK) bound to both cell lines in the presence of HK; however, in the absence of HK PK also bound only to CHO-K1 cell surface suggesting that PGs/GAGs may interact with PK. Once HK/PK complex is assembled on cell surface and lysates of both cell lines PK turns to plasma kallikrein (huPK) and both prolylcarboxypeptidase (PRCP) and cathepsins may participate in this process. The intact HK assembled to cell surface and lysates of both cell lines and in the absence of PK/huPK is cleaved in one site and probably PRCP or tissue kallikrein may process HK in this circumstances. The cell membrane interaction of plasma kallikrein-kinin system proteins through binding and internalization can result in liberation of HK fragments and huPK pericellular activity which may influence in pathological and physiological process.
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    Interação do cininogênio humano de alta massa molecular com a superfície celular: envolvimento dos processos de endocitose e proteólise
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-06-30) Melo, Kátia Regina Brasil [UNIFESP]; Motta, Guacyara da [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Angiogenesis and hemostasis are among the most consistent host responses associated with cancer, and these two pathways interrelate with blood coagulation and fibrinolysis influencing tumor angiogenesis directly, thereby contributing to tumor growth. Since the tumor survival depends on blood supplement it has inspired many researchers to search for anti-angiogenic factors and to draw anti-angiogenic strategies for cancer treatment. The plasma kallikrein-kinin system is related to vascular biology and interacts with many physiologic processes such as coagulation, fibrinolysis, complement and renin-angiotensin, it regulates local blood pressure by bradykinin release (BK) and has both anti-thrombotic and pro-fibrinolitic activities. High molecular weight kininogen (HK) plays two roles in angiogenesis process, because BK promotes angiogenesis and kinin free HK (HKa) inhibits angiogenesis. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG) may act as structural constituents of extracellular matrix, and those HSPG on cell surface may participate on processes such as endocytosis and vesicular uptake, regulating molecule traffic inside and outside cellular compartments. Different vesicles contribute on endocytosis depending on cell type and environment conditions of growth. The signaling pathways regulate all cell processes activities. The effectors in the pathways include transcription factors that control gene expression, the regulation of secretion apparatus, the metabolic enzymes, the structural and motor elements on cytoskeleton, the cell surface receptors, the cell cycle regulating proteins and membrane ionic channels. Some signaling pathways converge on all these effectors systems. The integration of different signals determine cell behavior, for instance, if cell secretes, moves, growths, proliferates and differentiates. The aim of the present study was analyze the HK interaction with surface of epithelial cells from human breast and CHO. The specific objectives in our work were to study the possibility of HK endocytosis, its processing and activity, in non-metastatic comparing to metastatic cells. In both CHO-K1 and CHO-745 cell lines we confirmed that HSPG plays role in ATP dependent and caveolae mediated endocytosis driven to endosomes the HK assembled on cell surface; we verified kinin release activities of both serine and cysteine proteases on cell surface in pH 7,35 of both cells lines CHO-K1 and CHO-745; both BK and HSPG are important in HK endocytosis; in both cells lines, and absence of Zn2+ and presence of 2% or 10% serum in medium, HKa has proliferative action, and glycosaminoglycans influence in HK activity on CHO-K1 proliferation. Both HK and HKa interactions were evaluated in mammary epithelium cells with different degrees of metastasis. The MCF-10A (non metastatic) interact more with both HK and HKa comparing to other two tumor cells, probably because their higher chondroitin sulfate content in tumor cells surface; the ratio between BK release in medium/BK internalized is higher in MDA-MB-231 cells (high degree of metastasis). In the absence of Zn2+ and presence of serum 2% or 10% in medium, within 24 h, HKa increased the proliferation of both MCF-10A and MCF-7 (middle metastatic) cells, and within 48 h the proliferation decreased in MCF-7 cells; in MDA-MB-231 both HK and HKa decreased cell proliferation and the presence of the serum changes the effect of both in 24 h, in 48 h only HK decreased cell proliferation in the presence of serum 2%. In MCF-7 Akt expression increased compared to non treated cells (control), except in cells treated with HKa in 48 h, ERK1/2 was detected in all conditions tested and c-Myc expression increased compared to non treated cells (control); in MDA-MB-231, HK or its fragments, and HKa increased Akt expression in 24 h; although p-38 is present in these cells in all conditions, HK or its fragments, and HKa promoted changes in p-38 expression, in similar manner in the presence of serum 2% or 10% in medium. The MDA-MD-231 cells migrated after in incubation with either HK or HKa in medium containing 2% or 10% serum and absence of zinc. The present study confirms the HSPG participation in cellular uptake of HK/HKa assembled on cell surface and fused with endosomes; the enzyme action of both serine and cysteine proteases classes in kinin release in incubation buffer in pH 7,35; the importance of both BK and HSPG in HK endocytosis; the involvement of caveolae in this process, and suggests the importance of zinc ions in proliferation processes related to uPAR or suPAR participation. Future studies on cell signaling may help in evaluation of cell cycle under HK/HKa treatment.
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    Sinalização de cálcio mediada pela enzima conversora de angiotensina I
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2008-11-26) Guimarães, Paola Bianchi [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A enzima conversora de angiotensina (ECA) é uma metaloproteinase que tem um papel importante na homeostase circulatória, uma vez que é capaz de modular a estrutura de uma diversidade de compostos, entre eles, angiotensina I (Ang I), convertendo-a no octapeptídeo vasopressor angiotensina II (Ang II), e inativando a bradicinina (BK), um peptídeo vasodilatador. Apesar de várias décadas de estudos, novos aspectos do mecanismo de ação da ECA foram elucidados, expandindo nosso conhecimento sobre seu papel, não só na regulação cardiovascular, mas também em outras diferentes áreas. Trabalhos recentes têm mostrado que a ECA pode também ser considerada uma molécula transdutora de sinal, uma vez que, tanto seu substrato endógeno BK (Fleming I, 2006), quanto vários de seus inibidores são capazes de gerar sinais intracelulares com subseqüente alteração de expressão gênica de algumas proteínas. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo verificar se o substrato natural da ECA, a Ang I, seria capaz de ativar a enzima em células CHO transfectadas permanentemente com a ECA recombinante, levando a uma sinalização intracelular mediada pela liberação ou entrada de cálcio. Com a utilização de fluoróforos indicadores de sinais de cálcio intracelular (Ca2+ i), observou-se que a administração de Ang I leva a um aumento de Ca2+ i, cuja resposta extinguiu-se com a incubação prévia do inibidor da ECA lisinopril. Verificamos também o aumento de Ca2+ i, quando se administrou Ang II, a qual foi capaz de se ligar à enzima, em ensaios de ligação. A hipótese dessa sinalização ocorrer via receptores de Ang II tipo 1 (AT1) foi descartada, uma vez que, não foi observada a expressão do RNAm ou proteína para esse receptor nas células transfectadas. Em resumo, nossos resultados mostram pela primeira vez a liberação de cálcio como segundo mensageiro pela ativação da ECA pela Ang II. Esse estudo evidencia um novo aspecto da biologia da ECA e abre novas perspectivas de estudo, em relação à importância fisiológica desta sinalização.