Influência dos glicosaminoglicanos na interação das proteínas do sistema calicreína-cinina plasmático na superfície celular
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Data
2006-02-22
Autores
Melo, Kátia Regina Brasil 
Orientadores
Motta, Guacyara da
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
The kallirein-kinin system comprises low and high molecular weight kininogens (LK and HK), tissue and plasma kallikreins, and was first recognized as a plasma and tissue proteolytic system responsible for bradykinin (BK) release. The main function of kininogens has been described as precursors of BK, a peptide which is not active unless it is released from kininogens. The plasma kallikrein-kinin system is related to vascular biology and it is involved and interacts with different systems such as coagulation, fibrinolysis, complement and renin-angiotensin systems. HK is a multidomain protein with antithrombin, antiadhesive and profibrinolytic activities. Recent studies have revealed that HK free from BK (HKa) inhibits angiogenesis while BK promotes angiogenesis. In blood and vascular cells some different proteins have been described as HK binding receptors: Mac-1 integrin (aMb-2 or CD11b/CD18) on granulocytes, the receptor that binds to the globular “heads” of C1q (p33/gC1qR), cytokeratin 1 (CK1) and urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) on HUVECs, and glycoprotein Ib-IX-V and thrombospondin on platelets. More recently both heparan sulfate and chondroitin sulfate have been described as HK putative receptors. The aim of this work was to study the influence of glycosaminoglycans (GAGs) on HK binding to cell surface and lysates and its processing using two different Chinese hamster ovary cell lines, CHO-wild type (CHO-K1) and CHO-745 (mutant) which is deficient in the synthesis of proteoglycans (PGs) due to lack of activity of xylosyl transferase. Biotin-HK (b-HK) bound to CHO-K1 cell surface in Zn2+ dependent manner. The b-HK level of binding was much higher on cell surfaces comparing to lysates from both cell lines and this binding was not reversible by 20 fold molar excess of unlabeled HK at both CHO-K1 and CHO-745. At 37°C the Bmax values for both CHO-K1 and CHO-745 are very similar but the Kdap for HK binding to CHO-K1 is 4.4 times higher comparing to CHO-745 suggesting that the presence of PGs/GAGs impair HK interaction with other putative receptors on cell surface. Considering the Bmax determinations at 4°C on CHOFor K1 it is 3.0 times lower comparing to Bmax at 37°C and on CHO-745 the Bmax value at 4°C is 1.4 times lower comparing to Bmax at 37°C. The difference of Bmax values at both temperatures for each cell line suggests that HK is internalized and confocal microscopy experiments detected HK internalized only on CHO-K1. Plasma prekallikrein (PK) bound to both cell lines in the presence of HK; however, in the absence of HK PK also bound only to CHO-K1 cell surface suggesting that PGs/GAGs may interact with PK. Once HK/PK complex is assembled on cell surface and lysates of both cell lines PK turns to plasma kallikrein (huPK) and both prolylcarboxypeptidase (PRCP) and cathepsins may participate in this process. The intact HK assembled to cell surface and lysates of both cell lines and in the absence of PK/huPK is cleaved in one site and probably PRCP or tissue kallikrein may process HK in this circumstances. The cell membrane interaction of plasma kallikrein-kinin system proteins through binding and internalization can result in liberation of HK fragments and huPK pericellular activity which may influence in pathological and physiological process.
O sistema calicreínas-cininas é composto pelos cininogênios de baixa e alta massa molecular (LK e HK), as calicreínas tecidual e plasmática, e foi primeiramente reconhecido como um sistema proteolítico plasmático e tecidual responsável pela liberação de bradicinina (BK). A principal função dos cininogênios tem sido descrita como precursores de BK, um peptídeo que não é ativo ao menos que seja liberado dos cininogênios. O sistema calicreína-cinina plasmático está relacionado à biologia vascular, e está envolvido e i terage com diferentes sistemas, tais como os sistemas da coagulação, fibrinólise, complemento e renina-angiotensina.O HK é uma proteína que apresenta multidomínios com atividades anti-trombótica, anti-adesiva e prófibrinolítica. Recentes estudos têm revelado que o HK livre de BK (HKa) inibe a angiogênese enquanto a BK promove a angiogênese. Nas células sangüíneas e vasculares algumas diferentes proteínas têm sido descritas como receptores ligantes de HK: a integrina Mac-1 (aMb-2 ou CD11b/CD18) em granulócitos, o suposto receptor aos domínios globulares do fator do complemento C1q (p33/gC1qR), a citoqueratina-1 (CK1) e o receptor do ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPAR) em HUVECs, a glicoproteína-Ib-IX-V e a trombospondina em plaquetas. Mais recentemente, ambos o heparam sulfato e o condroitim sulfato têm sido descritos como receptores putativos de HK. O objetivo do presente trabalho foi estudar a influência dos glicosaminoglicanos (GAGs) na ligação do HK na superfície e lisado celulares e o seu processamento usando dois modelos diferentes de linhagem de células obtidas a partir de ovário de Hamster Chinês, a selvagem CHO-K1 e mutada CHO-745, que é deficiente na síntese de proteoglicanos devido à perda de atividade da enzima xilosil-transferase. A ligação do HK-biotinado (b-HK) à superfície celular de CHO-K1 foi dependente de Zn2+. O nível de ligação do b-HK foi bem maior na superfície celular comparado ao lisado celular em ambas as linhagens, e esta ligação não foi revertida em CHO-K1 e CHO-745 pela adição de 20 vezes o excesso molar de HK não biotinado. A 37°C os valores de Bmáx para CHO-K1 e CHO-745 são muito semelhantes, entretanto o Kdap para a ligação de HK em CHO-K1 é 4,4 vezes maior quando comparado a CHO-745 sugerindo que a presença de PGs/GAGs prejudiquem a interação do HK com outros receptores putativos presentes na superfície celular. Considerando as determinações de Bmáx a 4oC em CHO-K1 o valor é 3,0 vezes menor comparado àquele a 37°C, e em CHO-745 o Bmáx a 4oC é 1,4 vezes menor comparado ao Bmáx a 37oC. A diferença nos valores de Bmáx nas duas temperaturas para cada linhagem celular sugere que o HK seja internalizado, eatravés de análise imunocitoquímica por microscopia confocal os experimentos detectaram que o HK é internalizado somente na linhagem CHO-K1. A procalicreína plasmática (PK) ligou a ambas as linhagens celulares na presença de HK; no entanto, na ausência de HK a PK apenas interage com superfície celular de CHO-K1, sugerindo que os PGs/GAGs podem interagir com PK. Uma vez que o complexo HK/PK seja formado na superfície e lisado celulares deambas as linhagens a PK é ativada a calicreína huPK e ambas a prolilcarboxipeptidase (PRCP) e as catepsinas podem participar desse processo. O HK íntegro associado à superfície e ao lisado celulares de ambas as linhagens foi hidrolisado na ausência de PK/huPK em uma ligação peptídica, e os resultados obtidos indicam a possibilidade de que essa enzima seja a PRCP ou uma calicreína tecidual nas condições do ensaio. A interação das proteínas do sistema calicreína-cinina plasmático com a membrana celular, através da sua ligação e internalização, pode resultar na liberação de fragmentos de HK e na atividade de huPK pericelular as quais podem influenciar em processos fisiológicos e patológicos.
O sistema calicreínas-cininas é composto pelos cininogênios de baixa e alta massa molecular (LK e HK), as calicreínas tecidual e plasmática, e foi primeiramente reconhecido como um sistema proteolítico plasmático e tecidual responsável pela liberação de bradicinina (BK). A principal função dos cininogênios tem sido descrita como precursores de BK, um peptídeo que não é ativo ao menos que seja liberado dos cininogênios. O sistema calicreína-cinina plasmático está relacionado à biologia vascular, e está envolvido e i terage com diferentes sistemas, tais como os sistemas da coagulação, fibrinólise, complemento e renina-angiotensina.O HK é uma proteína que apresenta multidomínios com atividades anti-trombótica, anti-adesiva e prófibrinolítica. Recentes estudos têm revelado que o HK livre de BK (HKa) inibe a angiogênese enquanto a BK promove a angiogênese. Nas células sangüíneas e vasculares algumas diferentes proteínas têm sido descritas como receptores ligantes de HK: a integrina Mac-1 (aMb-2 ou CD11b/CD18) em granulócitos, o suposto receptor aos domínios globulares do fator do complemento C1q (p33/gC1qR), a citoqueratina-1 (CK1) e o receptor do ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPAR) em HUVECs, a glicoproteína-Ib-IX-V e a trombospondina em plaquetas. Mais recentemente, ambos o heparam sulfato e o condroitim sulfato têm sido descritos como receptores putativos de HK. O objetivo do presente trabalho foi estudar a influência dos glicosaminoglicanos (GAGs) na ligação do HK na superfície e lisado celulares e o seu processamento usando dois modelos diferentes de linhagem de células obtidas a partir de ovário de Hamster Chinês, a selvagem CHO-K1 e mutada CHO-745, que é deficiente na síntese de proteoglicanos devido à perda de atividade da enzima xilosil-transferase. A ligação do HK-biotinado (b-HK) à superfície celular de CHO-K1 foi dependente de Zn2+. O nível de ligação do b-HK foi bem maior na superfície celular comparado ao lisado celular em ambas as linhagens, e esta ligação não foi revertida em CHO-K1 e CHO-745 pela adição de 20 vezes o excesso molar de HK não biotinado. A 37°C os valores de Bmáx para CHO-K1 e CHO-745 são muito semelhantes, entretanto o Kdap para a ligação de HK em CHO-K1 é 4,4 vezes maior quando comparado a CHO-745 sugerindo que a presença de PGs/GAGs prejudiquem a interação do HK com outros receptores putativos presentes na superfície celular. Considerando as determinações de Bmáx a 4oC em CHO-K1 o valor é 3,0 vezes menor comparado àquele a 37°C, e em CHO-745 o Bmáx a 4oC é 1,4 vezes menor comparado ao Bmáx a 37oC. A diferença nos valores de Bmáx nas duas temperaturas para cada linhagem celular sugere que o HK seja internalizado, eatravés de análise imunocitoquímica por microscopia confocal os experimentos detectaram que o HK é internalizado somente na linhagem CHO-K1. A procalicreína plasmática (PK) ligou a ambas as linhagens celulares na presença de HK; no entanto, na ausência de HK a PK apenas interage com superfície celular de CHO-K1, sugerindo que os PGs/GAGs podem interagir com PK. Uma vez que o complexo HK/PK seja formado na superfície e lisado celulares deambas as linhagens a PK é ativada a calicreína huPK e ambas a prolilcarboxipeptidase (PRCP) e as catepsinas podem participar desse processo. O HK íntegro associado à superfície e ao lisado celulares de ambas as linhagens foi hidrolisado na ausência de PK/huPK em uma ligação peptídica, e os resultados obtidos indicam a possibilidade de que essa enzima seja a PRCP ou uma calicreína tecidual nas condições do ensaio. A interação das proteínas do sistema calicreína-cinina plasmático com a membrana celular, através da sua ligação e internalização, pode resultar na liberação de fragmentos de HK e na atividade de huPK pericelular as quais podem influenciar em processos fisiológicos e patológicos.
Descrição
Citação
MELO, Katia Regina Brasil. Influência dos glicosaminoglicanos na interação das proteínas do sistema calicreína-cinina plasmático na superfície celular. 2006. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2006.