PPG - Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
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- ItemAcesso aberto (Open Access)Avaliações genéticas de indivíduos portadores de neutropenia primária crônica(Universidade Federal de São Paulo, 2024-11-22) Menezes, Alef Nascimento [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0856630824759511; http://lattes.cnpq.br/9655284452340182Objetivo: Realizar avaliação bioquímica e molecular em indivíduos portadores de neutropenia crônica. Método: Estudo de coorte prospectivo, desenvolvido de 2021 a 2023, incluindo pacientes atendidos em um serviço de referência de neutropenia. Foram analisados pacientes com neutropenia congênita grave (NCG), neutropenia ciclíca (NC), neutropenia auto-imune (NA), neutropenia idiopática crônica (NI) e doença do depósito de glicogênio 1B (DAG1B). O projeto foi dividido em três etapas: genômica, análise de proteínas e transcrição. Para os ensaios de genômica, foi realizado o sequenciamento de todos os exons em busca de variantes em genes associados a neutropenia congênita. Para os ensaios de proteômica utilizou-se a técnica de Western-Blot para visualização da expressão da proteína hCAP18 e a medida da atividade das enzimas mieloperoxidase e elastase. O ensaio de expressão de RNAm do gene CAMP foi realizado pela técnica de PCR em tempo real (qPCR), utilizando RNA extraído a partir do sangue total. Resultados: Foram identificados cinco pacientes com NCG (sendo dois indivíduos parentes), dois pacientes com NC, quatro com NAI (sendo dois indivíduos parentes), dois com DDG1B e quatro com NIC. No presente estudo, observou-se que o gene associado ao maior número de variantes foi o gene ELANE. Além do mais, foram observadas três novas variantes não descritas anteriormente na literatura, sendo duas variantes presentes no gene ELANE e uma variante no gene TAFAZZIN, associadas a NCG e a NC. Após a identificação das variantes genéticas, foi avaliada a expressão do gene CAMP e observou-se uma redução da expressão desse gene em indivíduos portadores de NCG quando comparado com outras neutropenias. Como o gene CAMP codifica a proteína hCAP18, foi realizada a avaliação da expressão dessa proteína nos pacientes portadores de neutropenia crônica. Os resultados mostraram ausência de expressão da hCAP18 nos pacientes com NCG, apresentando níveis indetectáveis também após o uso da medicação de proliferação celular na medula (filgrastrim). Nos indivíduos com NC, observou-se a ausência da expressão da hCAP18 durante a fase neutropênica, porém com expressão evidente na fase de recuperação neutrofílica. A expressão do hCAP18 também foi detectada nos pacientes com NAI, NIC e DDG1B, apesar da neutropenia pronunciada, e no grupo controle. Dessa forma, para avaliar o nível de maturação dos neutrófilos dos indivíduos portadores de NCG e NC, avaliou-se a atividade da mieloperoxidase e da elastase, havendo uma diminuição considerável nos indivíduos com variantes no gene ELANE, o que pode estar acarretando em um pior prognóstico dessas enfermidades. Conclusão: Dessa forma, a investigação molecular e bioquímica, juntamente com a associação de outras técnicas, como a pesquisa da expressão dos níveis plasmáticos do hCAP18 podem ser ferramentas poderosas de triagem destas doenças, diminuindo a necessidade de testes invasivos, inclusive ainda na infância, podendo viabilizar um tratamento precoce, similar a deficiência de glicose-6-fosfato.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Óxido nítrico como um mediador da adaptação celular em resposta ao estresse nutricional em células de melanoma metastático humano SK-MEL-28(Universidade Federal de São Paulo, 2024-11-08) Barboza, Leticia Torres [UNIFESP]; Monteiro, Hugo Pequeno [UNIFESP]; Simabuco, Fernando Moreira; http://lattes.cnpq.br/6362783289622710; http://lattes.cnpq.br/6154759166234850; https://lattes.cnpq.br/3888835062633252O melanoma é o tipo mais agressivo de câncer de pele, com alta taxa de mortalidade devido à sua rápida progressão e capacidade metastática. Durante sua progressão, a proliferação acelerada das células tumorais leva à limitação no suprimento de oxigênio, fatores de crescimento e outros nutrientes, promovendo condições de estresse que desencadeiam adaptações celulares essenciais para a sobrevivência, proliferação e promoção de metástases. As vias de sinalização PI3K/Akt/mTOR (PI3K) e Ras/Raf/MEK/ERK (MAPK) são vias canonicamente alteradas no melanoma, que desempenham papéis cruciais na resposta ao estresse e na progressão tumoral, regulando processos de sobrevivência, crescimento e diferenciação celular. Além disso, o óxido nítrico (NO), atua como um modulador chave no câncer, incluindo o melanoma, ao regular vias oncogênicas como PI3K e MAPK, através da sinalização por S-nitrosilação. Este estudo teve como objetivo investigar o papel do NO na adaptação celular de células de melanoma metastático humano (SK-MEL-28) sob estresse nutricional induzido pela privação de soro fetal bovino (SFB). Foram realizadas análises de proliferação, morfologia celular, expressão e ativação de proteínas das vias PI3K e MAPK, quantificação dos níveis de NO, além de ensaios de clonogenicidade. Nossos resultados indicam que a privação de SFB reduz a proliferação celular, altera a morfologia e modula a expressão e ativação das vias PI3K e MAPK, além de promover um aumento significativo nos níveis de NO. Nessas condições, tratamento com o doador de NO (DETA-NONOato) aumentou NO a níveis suprafisiológicos, suprimindo a proliferação e a ativação das vias mencionadas. . Por outro lado, a inibição da produção de NO por L-NAME restaurou parcialmente o fenótipo de células incubadas na presença de SFB, modulando também a expressão do fator de transcrição MITF e a capacidade de formação de colônias. Esses achados sugerem que o NO desempenha um papel modulador na adaptação celular em resposta ao estresse nutricional, o que pode oferecer novas perspectivas terapêuticas para o tratamento do melanoma metastático, considerando a limitação das terapias atuais em lidar com a resistência tumoral característica do melanoma.
- ItemEmbargoAção de heparinas na atividade antiangiogênica in vitro e in vivo: potencialização do efeito de anti-VEGF pela heparina 6-O-dessulfatada(Universidade Federal de São Paulo, 2024-11-07) Fetter, Bruna Zancanelli [UNIFESP]; Dreyfuss, Juliana Luporini [UNIFESP]; Regatieri, Caio Vinicius Saito [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3274977342997227; http://lattes.cnpq.br/2390066977030420; http://lattes.cnpq.br/4393528345310776A angiogênese, processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir de uma vasculatura preexistente, desempenha um papel crucial em várias doenças oculares, como a Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI). Seu processo é altamente controlado por uma interação complexa de fatores pró-angiogênicos e antiangiogênicos. A molécula reguladora pró-angiogênica mais estudada nesse processo é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que desempenha uma função importante na sobrevivência, proliferação e migração de células endoteliais. O Bevacizumabe (Bev), uma versão humanizada do anticorpo monoclonal anti-VEGF, foi desenvolvido para atuar na redução da angiogênese em várias doenças, como o câncer e neovascularização ocular. A heparina, um glicosaminoglicano sulfatado, também apresenta capacidade de se ligar e modular a atividade do VEGF, tendo demonstrado através de suas formas quimicamente modificadas um comportamento de fator antiangiogênico. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar o potencial antiangiogênico da heparina quimicamente modificada 6-O-dessulfatada (Hep6-O) e a possível potencialização da ação antiangiogênica da combinação de Hep6-O + Bev para o desenvolvimento de novas terapias antiangiogênicas. Para isso, Hep6-O foi modificada a partir da heparina suína não fracionada (HNF); em seguida, foi avaliada a atividade anticoagulante de HNF e Hep6-O. Para os ensaios in vitro, utilizaram-se as Células Endoteliais da Aorta de Coelho (RAEC) para investigar a viabilidade, proliferação, migração celular, formação de estruturas do tipo capilar e síntese de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) após o tratamento com Hep6-O, Bev e Hep6-O + Bev. Os ensaios in vivo utilizaram o modelo de neovascularização de coroide induzida por laser (CNV) em ratos Zucker magros tratados com injeção intravítrea de Hep6-O, Bev e Hep6-O + Bev, analisados em microscópio de imunofluorescência (CEUA 9900220818). Além disso, estudos de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) e Dicroísmo Circular (CD) foram conduzidos para avaliar a interação molecular e as alterações na estrutura secundária de fatores de crescimento (FGF-2, PDGF-BB e VEGF-165) frente a HNF, Hep6-O, Bev e suas combinações. Os resultados indicam que Hep6-O apresentou baixa atividade anticoagulante quando comparada à HNF. Os estudos in vitro mostraram que RAECs tratadas com Hep6-O, Bev e Hep6-O + Bev não apresentaram citotoxicidade em nenhuma concentração testada. Por outro lado, Hep6-O apresentou efeito antiangiogênico, sendo este efeito potencializado por Hep6-O + Bev quando comparado com Hep6-O ou Bev isolados, levando a uma redução significativa na proliferação, formação de estruturas tipo tubo capilar e migração das células endoteliais em todas as concentrações testadas quando comparadas ao controle. Em relação a síntese de GAGS, Hep6-O + Bev estimulou a biossíntese de GAGs sulfatados, principalmente o heparam sulfato secretado para o meio de cultura, sendo este aumento maior quando comparado aos tratamentos isolados com Hep6-O ou Bev. Os estudos in vivo mostraram uma redução significativa na área de neovascularização de coróide após 14 dias de injeção intravítrea de Hep6-O e Bev quando comparadas ao controle (salina), sendo este efeito potencializado por Hep6-O + Bev. Os dados de SPR mostraram que dependendo do fator de crescimento, há ligação entre as heparinas e o domínio de ligação aos fatores de crescimento aqui avaliados, enquanto os espectros de CD indicaram mudanças conformacionais nas proteínas e modulação de suas atividades. Com isso conclui-se que Hep6-O apresenta características de fator antiangiogênico, potencializando a ação do Bev, sugerindo uma possível sinergia entre as duas moléculas na inibição da angiogênese. Hep6-O não apenas mantém suas propriedades antiangiogênicas, mas também apresenta baixa atividade anticoagulante, o que pode reduzir os riscos associados a terapias prolongadas. Os ensaios de interação molecular mostraram que Hep6-O modula a ligação do VEGF e do FGF aos seus receptores, interferindo na ativação desses fatores e inibindo a angiogênese de forma mais eficaz quando em combinação com Bev. Estes achados sugerem que a coadministração de Hep6-O + Bev pode representar uma estratégia promissora para o tratamento de doenças neovasculares, como a DMRI. Estudos clínicos futuros são necessários para validar os efeitos terapêuticos dessa combinação e explorar o seu potencial completo.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Síntese, estudos conformacionais e de interação de fragmentos do receptor AT1 com análogos da angiotensina II contendo marcador de SPIN TOAC(Universidade Federal de São Paulo, 2006-05-30) Lopes, Douglas Duarte [UNIFESP]; Nakaie, Clovis Ryuich [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1133653893267841; http://lattes.cnpq.br/5616394796684637Esta tese procurou desenvolver um projeto cujo objetivo principal foi o de testar uma estratégia inovadora de monitoramento espectroscópico de interação agonistafragmento de um receptor transmembranar. Neste caso, as opções de investigação destas interações entre peptídeos pequenos e no geral, muito solúveis são difíceis mas, seriam de grande relevância, no caso de poderse verificar com qual região (ou regiões) de um receptor, o seu agonista apresenta maior tendência de interação. Este tipo de informação seria certamente de enorme valia para o auxílio na elucidação do mecanismo de ligação do agonista e do funcionamento de um determinado receptor. Com base nestas considerações, desenvolveu nesta tese, uma estratégia de investigação da interação do peptídeo vasoativo angiotensina II (AII), através de um análogo paramagnético, com o seu receptor AT1. Levandose em conta, hipóteses já existentes na literatura que destacam um sítio de interação do agonista com um segmento híbrido ligando as regiões Nterminal (1827 ou P15) e a terceira alça externa (266278 ou P13) do AT1, alguns fragmentos ligando estas duas regiões foram inicialmente sintetizados. Aproveitando esta fase inicital, procurouse investigar também problemas de dificuldades de síntese pois, em alguns análogos, havia a necessidade de formação de pontes dissulfeto entre segmentos distintos ou mesmo pelo fato de alguns, serem longos e bastante hidrofóbicos (6697, TM32), o que normalmente reduz bastante o rendimento da síntese. Em termos dos principais resultados obtidos, podese destacar: a) A análise da síntese no caso da seqüência transmembranar TM 32 (e de seu fragmento menor TM 16) por serem longas e fortemente hidrofóbicas mostrou clara dificuldade na parte sintética, principalmente à medida que ocorre o crescimento peptídico. O rendimento final foi de cerca de 25% ao final da síntese do TM 32, analisandose os perfis de HPLC do material bruto clivado da resina. O tempo de retenção de cada fragmento (crescimento de 8 em 8 resíduos) destacou uma clara correlação linear entre o tempo de retenção em HPLC e a hidrofobicidade de cada fragmento, concordante portanto com o aumento também linear da hidrofobidade de cada segmento em função do seu tamanho. Estudos de solvatação destas peptidilresinas, tanto por medidas do tamanho dos grãos solvatados quanto da mobilidade das cadeias peptídicas e da matriz polimérica obtida por RPE de peptidilresinas do TM32 marcadas com TOAC, indicaram que DCM e DMF foram os melhores solventes no começo da síntese mas, os piores ao final, quando a vantagem passou a ser do NMP e DMSO, devido ao aumento da hidrofobicidade da matriz polimérica. b) No caso dos demais fragmentos do receptor AT1, envolvendo os segmentos P15 e P13, notaramse as esperadas dificuldades na fase de acoplamento de aminoácidos, principalmente em tamanhos que abrangem de 5 a 15 aminoácidos, conforme já relatado na literatura. De qualquer modo, a parte mais crucial da síntese destes peptídeos foi o da formação da ponte dissulfeto entre os resíduos de Cys presentes em cada um dos fragmentos acima mencionados. Os peptídeos contendo o espaçador C11 ou GGC11GG não foram obtidos pela inviabilidade da formação da ponte SS, indicando a forte dependência desta reação às conformações dos mesmos que podem facilitar ou não a aproximação necessária dos grupos sulfidrilas para a reação de oxidação. c) Em termos conformacionais obtidos por CD, os fragmentos do AT1 apresentaram no geral, estruturas estendidas ou pouco estruturadas em pH neutro mas, com perfis em muitos casos, diferenciados entre si. Em raros compostos e situações, notouse a indução de conformação do tipo hélice como foi observado no caso dos peptídeos P15P13c e P15C6P13 quando em alta concentração de TFE ou em pH alcalino, no caso do primeiro análogo. Além do mais, destaquese a alta flexibilidade do composto P15(C11)2P13 (tanto na variação de pH quanto na quantidade de TFE), possivelmente devido à elevada dinâmica de uma estrutura que contem mais de duas dezenas de grupamentos alifáticos do tipo –CH2no meio de sua seqüência. d) O tópico mais relevante e final do presente estudo envolveu o monitoramento da possível interação do análogo ativo da AII (TOAC1AII) com todos os fragmentos obtidos do AT1, via espectros de RPE. Dos oito segmentos do receptor testados, P15C6P13 e P15(C11)2P13 foram os que interagiram com este agonista, vindo a seguir e em menor intensidade, o fragmento P15P13c. Houve um incremento da imobilização de cerca de 3 vezes do TOAC1AII. no caso da interação com os dois primeiros análogos, indicando significativa associação entre estes fragmentos do receptor com o agonista ativo TOAC1AII. E reforçando estes indícios de formação deste complexo intermolecular, observouse também uma clara diminuição dos valores de desdobramento hiperfino isotrópico (aN), o que indica a passagem do radical nitróxido do TOAC para um ambiente mais apolar, devido talvez ao tipo de complexo formado com os fragmentos do receptor. Em suma, esta estratégia inovadora de, por RPE e emprego de agonista contendo um marcador de spin do tipo aminoácido (TOAC), se mostrou eficiente na detecção de uma interação entre o agonista e uma região do receptor do mesmo. Estes dados iniciais deixam em aberto portanto, uma estratégia espectroscópica diferenciada e que pode ser bastante útil no estudo de qualquer interação agonistareceptor. Apenas como informação adicional, o análogo inativo da AII (TOAC4AII), utilizado como espécie de controle, não apresentou interação com os segmentos do AT1 acima mencionados, com exceção do fragmento transmembranar TM 32. Como o derivado TOAC4AII é inativo, admitese que esta ligação apenas com o segmento transmembranar TM 32 do AT1 é inespecífica, não havendo correlação com a hipótese mais amplamente aceita de ligação agonistaAT1 envolvendo de algum modo, os segmentos P15 e P13. E em termos de encontrar alguma correlação entre conformação dos segmentos do receptor e o grau de interação com o análogo do agonista, podese apenas destacar que os peptídeos que mostraram maior tendência a adquirir uma conformação mais estruturada, do tipo hélice em TFE, foram exatamente os dois que apresentaram tendência de interação com o TOAC1AII.
- ItemEmbargoPapel do sistema calicreína-cininas na recidiva de glomeruloesclerose segmentar e focal(Universidade Federal de São Paulo, 2023-10-25) Fonseca, Fernanda Maria Casimiro da [UNIFESP]; Pesquero, João Bosco [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0856630824759511; http://lattes.cnpq.br/5756089105853152Introdução: A GESF é a principal causa de doença renal no mundo, sendo o podócito a principal célula afetada. A maioria dos casos de GESF é de causa idiopática (80%). Embora o transplante seja um potencial tratamento, até 50% dos pacientes têm recidiva de GESF após o transplante. Em 1972 foi sugerido a presença de fatores circulantes, responsáveis pela recidiva de GESF primária após o transplante. Objetivo: Estando a bradicinina relacionada com processos inflamatórios, remodelação celular e aumento da permeabilidade o objetivo deste trabalho é analisar o papel do sistema calicreína-cininas na recidiva de GESF pós-transplante; assim como mapear potenciais vias ativadas nessa patologia, a fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos na recidiva de GESF e poder, assim, contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Métodos: Podócitos imortalizados foram incubados com plasma de indivíduos com ou sem recidiva de GESF pós-transplante e com bradicinina para análise morfológica. Técnica de espectrometria de massas foi utilizada para analisar a taxa de formação de bradicinina e seus metabólitos nos plasmas de indivíduos com e sem recidiva de GESF. Gel de acrilamida foi utilizado para analisar perfil proteico dos plasmas dos indivíduos com e sem recidiva de GESF pós-transplante, assim como foi utilizada análise de proteína específica por Western Blotting e análise de proteínas dos diferentes plasmas por cromatografia líquida de alta densidade. Resultados: 15 pacientes foram selecionados para o estudo, seis com recidiva (GESF) e nove sem recidiva (nGESF) de GESF pós-transplante. Quando incubados com os plasmas nGESF, a morfologia e estrutura dos podócitos são preservadas e quando incubados com plasmas recidivados, a sua morfologia aparente é alterada. A bradicinina mostrou efeito semelhante ao plasma com GESF na morfologia dos podócitos, o qual foi inibido na presença de HOE-140. Ao incubar os podócitos com plasmas GESF e nGESF juntos na mesma proporção, os plasmas nGESF tiveram um efeito de preservar a estrutura dos podócitos na presença de plasma GESF. A produção de bradicinina no grupo com GESF ocorreu de forma mais rápida comparado ao grupo nGESF, estando o sistema de produção de bradicinina no grupo GESF 2,5 vezes mais ativado comparado ao grupo nGESF. No grupo GESF, a degradação de bradicinina também ocorre mais rapidamente, assim como a produção dos seus metabólitos, com destaque para o metabólito BK2-9, com síntese 7,5 vezes maior. No gel de acrilamida, foi possível identificar que o grupo nGESF possui uma banda entre 140 – 260 kDa 2 vezes mais presente comparado ao grupo GESF, resultado também visto por meio da cromatografia líquida, sendo esta banda identificada como dipeptidil-peptidase IV por experimento de Western Blotting. Experimentos de atividade enzimática de dipeptidil-peptidase IV mostraram que esta enzima está 2,6 vezes mais ativa no grupo nGESF, sendo as frações 15 e 16 da cromatografia líquida com maior atividade. As frações 15 e 16 de plasma nGESF foram incubadas com podócitos na presença de plasma com GESF, na qual a fração 16 foi capaz de reduzir significativamente a produção de colágeno. Tendo a DPPIV papel importante na degradação de fator 1 derivado de células estromais (SDF-1), o qual tem importante função na produção de colágeno, o inibidor do receptor de SDF-1, AMD3100, foi incubado com plasmas GESF em podócitos e foi observado que AMD3100 inibiu o efeito causado pelo plasma GESF na morfologia dos podócitos. Conclusão: O plasma de indivíduos com recidiva de GESF é capaz de alterar a estrutura e morfologia dos podócitos in vitro, possui menor quantidade e atividade de DPP-IV, estimula síntese de colágeno pelos podócitos, assim como, sintetizam bradicinina e a degradam de forma mais rápida comparado ao plasma de indivíduos sem recidiva de GESF. O colágeno produzido pelo podócito, estimulado pelos fatores circulantes, pode interferir na composição da barreira de filtração glomerular, prejudicando o processo de filtração. A menor atividade de DPP-IV pode levar ao acúmulo de SDF-1a na circulação, e, em caso de dano aos podócitos pelos fatores circulantes, não há bloqueio do SDF-1a para que haja ativação de células-tronco progenitoras e reconstituição da barreira de filtração glomerular. Estudos para confirmação dessas hipóteses e para melhor compreensão do papel do colágeno produzido e do SDF-1a na recidiva de GESF, a fim de estabelecer a inibição de CXCL12 como potencial estratégia terapêutica em distúrbios glomerulares, se fazem necessários.