Navegando por Palavras-chave "Carrapatos"
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- ItemSomente MetadadadosBmcistatina, inibidor de cisteinoproteases presentes em corpo gorduroso de carrapato Boophilus microplus: clonagem, expressao, purificacao e caracterizacao(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006) Lima, Cassia Arantes de [UNIFESP]
- ItemSomente MetadadadosCaracterização cinética e funcional do inibidor recombinante de FXa da coagulação sanguínea, estraído a partir da glândula salivar do carrapato Amblyomma cajennense(Acari: Ixodidae) (Fabricius, 1787)(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2007) Simons, Simone Michaela [UNIFESP]; Chudzinski-Tavassi, Ana Marisa [UNIFESP]Muitas substâncias anticoagulantes provenientes da secreção salivar e das glândulas salivares de diversas espécies de carrapatos têm sido relatadas. Através de métodos de bioquímica clássica, previamente foram isolados da saliva do carrapato Amb!Jomma eqjenneme 2 inibidores de FXa, um de trombina e outro da agregação plaquetária. No presente trabalho, um inibidor de FXa foi isolado da saliva através de uma cromatografia de troca iônica em resina Resource -Q (Sistema FPLC- GE), o qual foi denominado INFXa, é capaz de inibir a atividade amidolítica do FXa sobre o substrato cromogênico específico S-2765 (IC50 = 0,2 /-lg) de maneira dose-resposta além de prolongar o tempo de tromboplastina parcial ativada do plasma humano. A inibição do FXa não é alterada pelo INFXa na presença do zimogênio (FX). Através de um gel bidirnensional da saliva 110 spots foram revelados, sendo que suas massas moleculares variaram de 110 a 9 kDa e o pl entre 3.5 a 9.6. Entretanto, uma maior quantidade de proteínas se localizaram entre pl de 4.0 a 7.0 sugerindo um caráter mais ácido à saliva. As seqüências de aminoácidos de oito spots foram obtidas através da espectrometria de massa (MALDI-TOF e Q-TOF), as quais apresentaram similaridade com hemoglobina de manúferos, mas não com inibidores já conhecidos. A partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amb!Jomma cajennense foi previamente clonado e expresso um importante inibidor denominado Amblyomin X, que inibe o FXa da coagulação como induz a remissão de tumor de melanoma implantado em camundongo, sem contudo afetar células normais. O Amblyomin-X foi inicialmente expresso em E.eoli transformada com o vetor de pAE o qual insere uma cauda de 6 resíduos de histidina à molécula. Como o Amblyomin-X foi obtido contendo cauda de poli histidina o que dificulta a validação do sistema para testes pré-clínicos. Neste trabalho avaliou a expressão de Amblyomin-X expresso em PÚhia pastoris. O inibidor foi então expresso em sistema de levedura utilizando a Piehia pastoris tendo como vetor o pPIC9K. Este sistema oferece a vantagem de produzir o inibidor sem a cauda de histidina e ser um processo escalonável. Foram produzidos 5,0 litros do inibidor em um fermentador. O Amblyomin-X foi separado do meio de cultura por dois processos distintos de clarificação, por membranas de fibra oca e por centrifugação, ambos os materiais foram parcialmente purificados através de uma cromatografia de troca iônica em resina Source Q (Sistema AKTA purifier - GE) em sistema rastreável e validado. O Amblyomin-X expresso em de levedura inibiu a atividade amidolítica do FXa sobre o substrato cromogênico S-2765 (Ki= 0,6 uM), e prolongou o tempo de tromboplastina parcial ativada de maneira dose-dependente, a inibição do FXa foi alterada pelo Amblyomin-X na presença do zimogênio (FX) na reação, reproduzindo as atividades encontradas no Amblyomin-X expresso...(au).
- ItemSomente MetadadadosCaracterização de inibidores da coagulação sanguínea e da agregação plaquetária presentes na saliva do carrapato Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae) (Fabricius, 1787)(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2003) Simons, Simone Michaela [UNIFESP]; Chudzinski-Tavassi, Ana Marisa [UNIFESP]Os carrapatos constituem um dos mais importantes grupos de artropode parasitas hematofagos de animais domesticos, silvestres e do homem. 0 Amblyomma cajennese constitui uma das principais especies de vetores de varios patogenos causadores de doencas como a babesiose, febre maculosa e Lyme simile. Objetivo: Avaliar a atividade da saliva do carrapato Amalyomma cajennese sobre os mecanismos de coagulacao, agregacao de plaquetas e fibrinolise, alem de isolar e caracterizar um inibidor de Fator Xa, um inibidor de trombina e um inibidor de agregacao plaquetaria. Metodos: A obtencao da saliva bruta foi realizada seguindo o metodo de Tatchell modificado. A atividade inibitoria sobre FXa e trombina, tanto da saliva bruta quanto das fracoes obtidas apos cromatografia foram avaliadas utilizando-se os substratos cromogenicos S-2765 e S-2238 respectivamente; a atividade fibrinolitica foi verificada em placas de fibrina humana, contendo plasminogenio e a inibicao da agregacao plaquetaria foi verificada tanto em PRP (induzida por ADP, colageno, ristocetina e acido araquidonico) quanto em plaquetas lavadas (induzida por colageno. Tanto o p1 quanto as massas moleculares das proteinas da saliva foram determinados por eletroforese bi-dimensional. 0 fracionamento das proteinas da saliva foi realizado atraves de cromatografia de troca ionica (Resource Q) eluida com um gradiente linear de NaCI (0-500mM), as fracoes com atividade inibitoria sobre FXa, trombina e agregacao plaquetaria foram separadas em pools, sendo que o Plli que apresentava atividade inibitoria sobre o FXa foi submetido a uma gel filtracao (TSK gel 2000 sw) e o material obtido denominado Amblyomim-X. A capacidade inibitoria do Amblyomin-X foi analisada frente diferentes condicoes (efeito de ions calcio, presenca de deferentes concentracoes do inibidor, diferentes tempos de incubacao e na presenca de componentes do complexo protrombinase). Resultados: A saliva bruta inibiu o FXa, a trombina e a agregacao plaquetaria, e um inibidor de FXa de cerca de 67kDa, denominado Amblyomin-X foi isolado. 0 Ambiyomin-X inibiu de forma eficiente e rapida o FXa isolado (IC50 de 4,7gg) e tambem inibiu a geracao de trombina no complexo protrombinase de forma dose...(au)
- ItemAcesso aberto (Open Access)Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de calicreína tecidual do tipo Kunitz presente em intestino de carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2013) Abreu, Patricia de Andrade [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1168789309568199; http://lattes.cnpq.br/6112145191990528O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus e um ectoparasito exclusivo de bovinos. No Brasil, e o vetor de agentes causadores da Babesiose, Anaplasmose e Riquetsiose, o que resulta em enormes prejuizos a pecuaria. O controle de R. microplus e feito principalmente pelo uso de acaricidas, no entanto a aquisicao de resistencia assim como a contaminacao dos produtos derivados de bovinos, faz com que a busca por metodos alternativos de controle sejam desenvolvidos. Um grupo de moleculas importantes na fisiologia desse carrapato sao os inibidores de proteases, ja tendo sido descrito inumeros inibidores de proteases da familia tipo Kunitz-BPTI envolvidos em processos como: controle da coagulacao, agregacao plaquetaria do hospedeiro vertebrado, mas tambem na resposta imune do proprio ectoparasito. Neste trabalho clonamos, expressamos e caracterizamos o inibidor de calicreina tecidual do tipo Kunitz, denominado de BmKK91. Esse inibidor apresenta dois dominios Kunitz-BPTI, massa molecular teorica de aproximadamente 16 kDa. O BmKK91 recombinante foi expresso em levedura P. pastoris, apresentando alto nivel de expressao. O inibidor foi purificado com uma unica etapa, em cromatografia de troca ionica. O inibidor purificado inibiu as serinoproteases tripsina, calicreina pancreatica porcina (PPK) e calicreina plasmatica humana (HuPK) (Ki = 0,2 nM, 300 nM e 847 nM, respectivamente). O BmKK91 purificado apresentou massa molecular de 13 kDa por SDS-PAGE, no entanto a massa molecular obtida por espectrometria de massa MALDI TOF esta de acordo com a massa molecular teorica esperada de 16,3 kDa. As perspectivas deste trabalho serao a caracterizacao de BmKK91 sobre calicreinas teciduais humanas que sao enzimas importantes em processos fisiopatologicos como: tumores e sua progressao e avaliacao do potencial vacinal de BmKK91 em bovinos.
- ItemSomente MetadadadosEstudos bioquímicos de inibidores de serinoproteases do carrapato Boophilus microlus: efeito do silenciamento gênico por interferência de RNA de um inibidor de tripsina do tipo Kunitz(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006) Sasaki, Sergio Daishi [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]
- ItemSomente MetadadadosEstudos moleculares de inibidores de serinoproteases das larvas do carrapato Boophilus microplus(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2002) Sasaki, Sergio Daishi [UNIFESP]; Tanaka, Aparecida Sadae [UNIFESP]A partir de extratos de larvas e ovos do carrapato Boophilus microplus foram purificados inibidores de serinoproteases (BmTIs) utilizando cromatografia de afinidade em tripsina-Sepharose. Os BmTIs apresentaram massas moleculares entre 6,2 kDa e 18,4 kDa e atividade inibitoria sobre tripsina, HuPK (calicreina plasmatica humana) e elastase de neutrofilos. Utilizando cromatografia de troca-ionica coluna Resource Q, os BmTls foram separados nas formas proteicas denominadas BmTI-A, BmTI-B, BmTI-C, BmTI-D, BmTI-E e BmTI-F. O material nao-retido na cromatografia em coluna Resource Q foi separado em coluna Mono S obtendo-se as formas BmTI-1, BmTI-2, BmTI-3, BmTI-4 BmTI-5, BmTI-6 e BmTI-7. Todas as formas de BmTIs apresentaram atividade inibitoria sobre tripsina com constante de dissociacao (Ki) na ordem de nM. As formas BmTI-A, BmTI-D, BmTI-2, BmTI-3 e BmTI-4, inibem elastase de neutrofilos e HuPK com Ki na ordem de nM. O BmTI-D mostrou ser o melhor inibidor de HuPK e o BmTI-4 mais eficiente para elastase de neutrofilos, com constantes de dissociacao (Ki) de 11,6 nM e 0,2 nM, respectivamente. As formas BmTI-A, BmTI-D, BmTI-2, BmTI-3, BmTI-4 e BmTI6 tiveram as porcoes N-terminais determinadas por sequenciamento automatico de aminoacidos, estas sequencias parciais permitiram a classificacao destes BmTIs dentro da familia dos inibidores de serinoproteases tipo Kunitz de tecido animal. Os BmTIs pos tripsina-Sepharose foram utilizados na imunizacao de bovinos, mostrando acao imunogenica (producao de anticorpos anti-BmTIs) e protetora contra a infestacao por esta especie de carrapato. Na tentativa de clonar o gene de um BmTI foram utilizadas duas estrategias de clonagem baseadas na sintese do cDNA a partir do RNA mensageiro de larvas do carrapato 8. microplus. 1) A construcao de uma biblioteca de...(au)