Navegando por Palavras-chave "Clonagem molecular"

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    BbCI, inibidor de cruzipaína de Bauhinia bauhinioides: isolamento do cDNA e expressão heteróloga
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2004) Hansen, Daiane [UNIFESP]; Sampaio, Misako Uemura [UNIFESP]
    O BbCI (Bauhinia bauhinioides Cruzipain Inhibitor) e um inibidor de cisteinoproteinase que mostra alta identidade sequencial com inibidores de planta do tipo Kunitz, porem nao apresenta nenhum residuo de cisteina. A inibicao da cruzipaina faz do BbCI um instrumento biotecnologico interessante no desenvolvimento de uma nova geracao de drogas para o combate a infeccoes causadas pelo Trypanossoma crua 0 BbCI tambem apresenta uma atividade inibitoria para HNE (Human Neutrophillus Elastase) enzima envolvida em varios processos fisiopatologicos. 0 gene codificante para BbCI foi clonado por RT-PCR usando oligonucleotideos degenerados, os quais foram sintetizados a partir da sequencia proteica previamente descrita. 0 produto amplificado foi inserido no vetor pGEM-T para sequenciamento. Uma vez confirmada a sequencia, oligonucleotideos internos foram sintetizados para a realizacao do RACE 5' e 3'(Rapid Amplification of cDNA Ends). A informacao gerada mostrou que o BbCI e inicialmente sintetizado como uma pre-pro-proteina apresentando a seguinte estrutura: 19 residuos de aminoacidos na regiao N-terminal, 164 residuos correspondentes a proteina nativa e 10 residuos na regiao C-terminal. A sequencia correspondente a cadeia madura foi subclonada no vetor de expressao pET-28a (Novagen). 0 BbCI foi produzido por expressao heterologa fusionado a uma sequencia de 6 residuos de histidinas com um sitio de clivagem de trombina entre eles. A expressao em E. coli BL21 (DE3) produziu o inibidor em grande escala o qual foi purificado por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA SuperFlow. A proteina de fusao foi submetida a clivagem com trombina e posteriormente purificada em gel filtracao Superdex 75a(au)
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    Clonagem molecular e expressão de reprolisinas da glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2001) Silva, Carlos Alberto da [UNIFESP]; Camargo, Antonio Carlos Martins de [UNIFESP]
    As metaloendopeptidases hemorrágicas dos venenos de serpentes (SVMPs), têm sido amplamente estudadas e demonstram açao direta sobre os componentes hemostáticos e a hemorragia, durante o envenenamento. Atualmente, sao agrupadas na família das reprolisinas juntamente com as proteínas reprodutivas de mamíferos e, de acordo com suas estruturas de multidomínios, sao subdivididas em 4 classes: P-I a P-IV. 0 fator hemorrágico HF3 é uma metaloendopeptidase isolada do veneno de B. jararaca, que apresenta dose mínima hemorrágica de 15 ng suficiente para causar a hemorragia de 1 cm z na derme de coelho. Sua atividade hemorrágica é dependente das suas pontes dissulfeto e da presença do átomo de zinco em seu centro ativo. E uma glicoproteína ácida (pI 3,9), que em condiçoes de desnaturaçao e reduçao apresenta massa molecular de 62 000 Da. A clonagem molecular do HF3 foi realizada inicialmente, pela técnica de immunoscreening da bMoteca cie cDNAs da glândula de veneno da B, jararaca, utilizando-se um soro anti-HF3. 0 clone isolado 6.1.1 de 1467 pb correspondeu a seqüência parcial do precursor do HF3. A autenticidade desse clone, foi confirmada pelo sequenciamento de aminoácidos de peptídeos internos oriundo da clivagem com endopeptidase Lys-C do HF3 nativo. Com o intuito de isolar o precursor completo do HF3, selecionamos duas técnicas alternativas de screening da biblioteca d cDNA, baseando-se no método de screening por PCR e a hibridizaçao de ácidos nucléicos com sonda de DNA marcada com digoxigenina. 0 sequenciamento parcial de nucleotídeos dos clones isolados, mostrou que todos codificam meta loendopeptidases, entretanto, 80 por cento corresponderam a precursores já descritos e os demais nao possuíram homologia com o HF3. De acordo com esses resultados, utilizamos dois métodos para tentar obter a regiao 5 que completaria o cDNA parcial do HF3, através da amplificaçao por PCR com oligonucleotídeos específicos para o HF3 e técnica de 5 RACE. 0 sequenciamento dos clones isolados permitiu identificar 3 clones obtidos pela técnica de VRACE. Todos possuem 974 pb, que codificam a extremidade 5 do HF3, pois 194 pb da porçao 3 sobrepoem-se com a porçao_(au).
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    Acesso aberto (Open Access)
    Clonagem, expressão e purificação de BMP-2 recombinante como ferramenta para avaliar o papel do receptor B1 das cininas na diferenciação osteoblástica induzida por BMP2
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-05-27) Silva, Marina Rodrigues e [UNIFESP]; Pesquero, Joao Bosco [UNIFESP]; Nagem, Ronaldo Alves Pinto; http://lattes.cnpq.br/7305428791149745; http://lattes.cnpq.br/0856630824759511; http://lattes.cnpq.br/5900039099570404; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O tecido ósseo é um tecido dinâmico, constantemente remodelado, que depende de diversos fatores para manutenção do equilíbrio entre formação e reabsorção óssea. Perdas e danos ocorridos neste tecido constituem um grave problema de saúde pública. Milhões de brasileiros sofrem, atualmente, com problemas relacionados a lesões musculoesqueléticas. O tecido ósseo é acometido por várias injúrias, entre as quais se destacam doenças congênitas e metabólicas, além de fatores externos, como fraturas. Todos esses comprometimentos despertam grande interesse na busca por um mecanismo capaz de reparar tecido ósseo lesado. Atualmente as técnicas de engenharia de tecido têm sido indicadas em tratamentos de lesões em tecido ósseo, por serem das mais promissoras terapias alternativas para reparo de danos ósseos. Existem vários mediadores envolvidos no processo de diferenciação osteogênica que buscam reparar e formar o tecido ósseo, sendo alguns desses mediadores as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs). Além desses, alguns sistemas estão sendo relacionados ao processo de diferenciação óssea, como é o caso do sistema calicreína-cininas. Esse sistema tem sido relacionado com a destruição da matriz óssea, porém, pouco se sabe até o momento do verdadeiro papel dos diversos componentes do sistema no referido processo patológico. Com a expressão e utilização da BMP-2 recombinante, o presente trabalho buscou elucidar o envolvimento do receptor B1 de cininas na indução do processo de diferenciação óssea. Para alcançar esse objetivo, a proteína BMP-2 foi clonada para a expressão da proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidina em sua porção N-terminal, capaz de se ligar a colunas de afinidade. Posteriormente, a viabilidade funcional da proteína expressa foi testada em ensaios de diferenciação no intuito de avaliar o papel do receptor B1 de cininas na osteogênese in vitro como perspectiva para futura avaliação in vivo.
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    Clonagem, sequenciamento, expressão e caracterização parcial da estrutura do Lopap, um ativador de protrombina da lagarta Lonomia obliqua
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2002) Reis, Cleyson Valença [UNIFESP]; Sampaio, Claudio Augusto Machado [UNIFESP]
    O contato da pele humana com cerdas de lagartas Lonomia obliqua, especie encontrada principalmente na regiao Sul do Brasil, causa, entre outros sintomas, urna severa sindroine hemorragica devido a uma coagulopatia de consumo ocasionada por agentes procoagulantes (ativadores de protrombina e fator X da coagulacao), presentes no veneno. O Lopap (Lonomia obliqua prothrornbin activator protease) e urna proteina de 69 kDa, ativadora de protrotnbina, purificada do extrato bruto das cerdas da taturana L. obliqua atraves de cromatografia de gel filtracao (Sephadex G 75) e fase reversa etn HPLC (coluna C4). A proteina purificada e capaz de ativar a protrombina de forma dose-dependente. Atraves de analise por SDS-PAGE, observou-se que o Lopap pode ser uma molecula composta por 4 cadeias identicas de 18 kD.a A atividade do Lopap e aumentada pela adicao de ions calcio, entretanto outros ions bivalentes, como magnesio ou zinco, nao produzem o mesmo efeito. O Lopap e inibido por imbidores de serino proteases como o PMSF e Trasylol. O peptideo fluorogenico, derivado da protrombina na regiao hidrolisada pela trombina (Abz-YQTFFNPRTGSQ-EDDnp), teve sua clivagem no sitio principal entre a ligacao Arg-Thr. Os parametros cineticos obtidos para este substrato foram: Kmapp de 4,5 pM, kcat de 5,32 seg 1 e wn kcatlKrnaPP1,2 x 106 M-1 s 1. O soro anti-lonomico reconhece o Lopap quando analisado atraves de reacao cruzada por imunodifusao radial O Lopap e capaz de provocar a formacao de trombos, induzir a incoagulabilidade sanguinea, a deplecao do fibrinogenio e causar urna diminuicao na contagem de plaquetas quando injetada na corrente sanguinea de ratos. Tambem foi observada conGestão e hemorragia nos...(au)