Clonagem molecular e expressão de reprolisinas da glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca
Data
2001
Autores
Silva, Carlos Alberto da 
Orientadores
Camargo, Antonio Carlos Martins de
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
As metaloendopeptidases hemorrágicas dos venenos de serpentes (SVMPs), têm sido amplamente estudadas e demonstram açao direta sobre os componentes hemostáticos e a hemorragia, durante o envenenamento. Atualmente, sao agrupadas na família das reprolisinas juntamente com as proteínas reprodutivas de mamíferos e, de acordo com suas estruturas de multidomínios, sao subdivididas em 4 classes: P-I a P-IV. 0 fator hemorrágico HF3 é uma metaloendopeptidase isolada do veneno de B. jararaca, que apresenta dose mínima hemorrágica de 15 ng suficiente para causar a hemorragia de 1 cm z na derme de coelho. Sua atividade hemorrágica é dependente das suas pontes dissulfeto e da presença do átomo de zinco em seu centro ativo. E uma glicoproteína ácida (pI 3,9), que em condiçoes de desnaturaçao e reduçao apresenta massa molecular de 62 000 Da. A clonagem molecular do HF3 foi realizada inicialmente, pela técnica de immunoscreening da bMoteca cie cDNAs da glândula de veneno da B, jararaca, utilizando-se um soro anti-HF3. 0 clone isolado 6.1.1 de 1467 pb correspondeu a seqüência parcial do precursor do HF3. A autenticidade desse clone, foi confirmada pelo sequenciamento de aminoácidos de peptídeos internos oriundo da clivagem com endopeptidase Lys-C do HF3 nativo. Com o intuito de isolar o precursor completo do HF3, selecionamos duas técnicas alternativas de screening da biblioteca d cDNA, baseando-se no método de screening por PCR e a hibridizaçao de ácidos nucléicos com sonda de DNA marcada com digoxigenina. 0 sequenciamento parcial de nucleotídeos dos clones isolados, mostrou que todos codificam meta loendopeptidases, entretanto, 80 por cento corresponderam a precursores já descritos e os demais nao possuíram homologia com o HF3. De acordo com esses resultados, utilizamos dois métodos para tentar obter a regiao 5 que completaria o cDNA parcial do HF3, através da amplificaçao por PCR com oligonucleotídeos específicos para o HF3 e técnica de 5 RACE. 0 sequenciamento dos clones isolados permitiu identificar 3 clones obtidos pela técnica de VRACE. Todos possuem 974 pb, que codificam a extremidade 5 do HF3, pois 194 pb da porçao 3 sobrepoem-se com a porçao_(au).
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2001. 162 p. ilus.