Navegando por Palavras-chave "DNA Recombinante"

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    Análise físico-química de hormônio de crescimento humano recombinante em diferentes etapas do processo de produção
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1998) Dalmora, Sergio Luiz [UNIFESP]; Bartolini, Paolo [UNIFESP]
    Padronizou-se metodologia de cromatografia liquida de alta efiCiência em fase reversa (RP-HPLC) isocratica para determinacao de hormonio de crescimento humano recombinante (rec-hGH) em extratos periplasmicos de E. coli. O procedimento possibilitou uma rapida analise inicial da qualidade e quantidade de hGH secretado no espaco periplasmico, imediatamente apos, ou mesmo durante a fermentacao. Considerando que a RP-HPLC nao identifica isomeros de massa, estes foram determinados atraves da analise paralela dos extratos periplasmicos por cromatografia liquida de alta efiCiência por exclusao molecular (HPSEC) e radioimunoensaio (RIE) das fracoes eluidas. O metodo permitiu obter em 24 h, do inicio do processo de fermentacao, uma avaliacao da atividade, identidade, rendimento e contaminantes relacionados ao hGH. Entre esses incluem-se os sulfoxidos e desamidados, dimero e formas de alta massa molecular. As metodologias padronizadas foram empregadas em diferentes etapas da producao de rec-hGH. O processo de fermentacao de E. coli transformada foi otimizado, escolhendo-se o melhor tempo de ativacao, que propiciou maior nivel de secrecao de hGH e a menor quantidade de formas alternadas. Analisou-se uma das primeiras fases do processo de purificacao, confirmando-se a ausencia de perdas significativas em formas polimericas. A liofilizacao foi aprimorada, possibilitando a preparacao e estudo de diferentes padroes. Todos esses estudos acrescentaram importantes conhecimentos para o controle de qualidade do produto farmaceutico injetavel. que foi realizado de acordo com as recomendacoes das Farmacopeias Europeia e Brasileira epm-015351.pdf
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    Clonagem e caracterização de um gene que codifica o antígeno de superfície de 82-kDa específico das formas tripomastigotas metacíclicas do Trypanosoma cruzi
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1995) Araya Rojas, Jorge Enrique [UNIFESP]; Silveira Filho, José Franco da [UNIFESP]
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    Clonagem e caracterização do gene que codifica o antígeno principal de diagnóstico do Paracoccidioides brasiliensis : expressão de epitopos da glicoproteína de 43000 Da (gp43) reconhecidos por anticorpos humanos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1996) Cisalpino, Patricia Silva [UNIFESP]; Travassos, Luiz Rodolpho Raja Gabaglia [UNIFESP]
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    Acesso aberto (Open Access)
    Clonagem, expressao da heparanase-1 humana e desenvolvimento de novo metodo para determinacao da atividade enzimatica
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2013) Melo, Carina Mucciolo [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7511274763693292; http://lattes.cnpq.br/1814847465463146
    Heparanase e uma endo-β-glucuronidase que possui duas isoformas: a heparanase-1 (HPSE) e a heparanase-2 (HPSE2). A HPSE tem atividade catalitica, ja a HPSE2 tem somente a funcao de regulacao. A HPSE, apos traducao tem 65 kDa na sua forma latente, sofre processamento proteolitico formando tres fragmentos, um de 50 kDa, e outros dois de 8 kDa e 6 kDa. Em mamiferos, a HPSE torna-se ativa apos a formacao de um heterodimero com os residuos de 50 kDa e 8 kDa. A superexpressao da HPSE ja foi descrita em processos inflamatorios e em carcinomas humanos com baixa taxa de sobrevida dos pacientes. Com a enzima recombinante ativa sera possivel investigar a HPSE, o que podera contribuir com o entendimento dos processos celulares que relacionam a expressao da HPSE com o desenvolvimento de tumores e processos inflamatorios. Pelos motivos apresentados, os objetivos do presente estudo foram clonagem, expressao da HPSE recombinante e desenvolvimento de novo metodo para determinacao da atividade enzimatica da HPSE. O cDNA da HPSE foi obtido de linhagem celular de cancer de mama (MCF-7). Apos sequenciamento, o fragmento de cDNA referente a fracao ativa da HPSE (50 kDa) foi clonado no vetor de expressao pGEX-2TK e transformado em E.coli BL21(DE3). A cultura de bacterias com vetor plasmidial recombinante, foi adicionado oÆisopropil-β-D-1-tiolgalactopiranosideo para inducao da expressao da HPSE recombinante. Apos lise celular do extrato bruto de bacterias, foi feita purificacao com coluna de cromatografia por afinidade. Foi realizado ensaio de atividade usando heparam sulfato biotinilado com a amostra da HPSE recombinante purificada e como controle foi utilizado extrato celular de cancer de mama metastatico (SKBR3). Verificou-se que a HPSE recombinante e ativa, porem a HPSE recombinante parece clivar menor quantidade de heparam sulfato quando comparado ao extrato celular de SKBR3, isso se deve provavelmente, a nao formacao do heterodimero na HPSE recombinante. Foi observado que o metodo de heparam biotinilado sofria interferencias quando usado com extrato bruto de bacterias. Portanto, foi desenvolvido um novo metodo de atividade enzimatica para determinacao da atividade da HPSE em extrato bruto de bacterias e nao so na amostra ja purificada. O novo metodo proposto e baseado no aumento de fluorescencia do reagente resazurin a 590 nm quando reduzido pela hidroxila anomerica do substrato fondaparinux. A hidroxila anomerica e gerada somente apos diGestão do substrato com a HPSE ativa. Este metodo mostrou-se sensivel a diferentes atividades enzimaticas da HPSE e a fluorescencia do reagente resazurin foi diretamente proporcional a quantidade de hidroxilas redutoras geradas pela atividade catalitica da HPSE. Comite de etica em pesquisa da Universidade Federal de São Paulo: 724462