Navegando por Palavras-chave "Engenharia genética"
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- ItemAcesso aberto (Open Access)Angiogênese da retina e coroide : biomarcadores e engenharia genética(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-11-30) Silva, Thiago George Cabral [UNIFESP]; Mattos, Rubens Belfort [UNIFESP]; Lima, Luiz Henrique Soares Gonçalves de [UNIFESP]; Regatieri, Caio Vinicius Saito [UNIFESP]; Luiz Henrique Soares Gonçalves de Lima : http://lattes.cnpq.br/0399713306487727; Caio Vinicius Saito Regatieri : http://lattes.cnpq.br/3274977342997227; http://lattes.cnpq.br/4270399167335564; http://lattes.cnpq.br/6865877242594519; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Objetivo: Comparar a concentração do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) no humor aquoso antes e após uma única injeção intravítrea de bevacizumabe (IVB) e estudar a concentração de 19 moléculas angiogênicas antes e após três IVBs mensais em olhos com doença macular relacionada à idade (DMRI) exsudativa, apontando os principais grupos de moléculas pró e antiangiogênicas e, ainda, descrevendo tratamentos de engenharia genética como o futuro terapêutico da angiogênese ocular, em especial o uso do CRISPR. Métodos: Na primeira publicação, pacientes com DMRI exsudativa foram tratados com uma única injeção (1,25 mg/0,05 mL). Amostras de humor aquoso foram obtidas antes da injeção, em uma semana, um mês e três meses de seguimento. Na segunda publicação, pacientes com DMRI exsudativa foram tratados com IVB mensal (1,25 mg/0,05 mL). Foram analisadas as concentrações de 19 moléculas angiogênicas a partir de amostras do humor aquoso obtidas antes de cada IVB. Parâmetros clínicos foram analisados para ambos os estudos. Foi realizada uma revisão da literatura das principais moléculas relacionadas à neovascularização da retina e coroide, das terapias antiangiogênicas oculares disponíveis e de tratamentos promissores em desenvolvimento. Resultados: Na primeira publicação, os níveis do VEGF reduziram e a acuidade visual (AV) melhorou significativamente em todos os períodos de acompanhamento, quando comparados à linha de base. A menor expressão do VEGF foi observada em uma semana e a mais intensa melhora da AV ocorreu um mês após o tratamento. Todos os parâmetros avaliados na tomografia de coerência óptica (OCT) apresentaram redução significativa no primeiro mês. Na segunda publicação, observou-se uma diminuição significativa do VEGF-A nos seguimentos de um e dois meses, com aumento significativo na concentração de sete moléculas: angiopoietina-2, endotelina-1, folistatina, fator de crescimento semelhante ao fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina, fator de crescimento de hepatócitos, interleucina-8 e fator de crescimento endotelial vascular-C. Houve melhora da AV aos dois meses e redução dos parâmetros do OCT em todos os períodos do estudo. Na terceira publicação, observaram-se 16 grupos de potenciais moléculas-alvo contra a neovascularização da retina e coroide, com 26 ensaios clínicos em andamento, sendo sete de terapias combinadas e utilização de vetores virais. A terapia genética modificou genes relacionados a doenças retinianas, diminuiu a ligação de fatores angiogênicos e a expressão do receptor do VEGF em lesões vasoproliferativas. Conclusões: Uma única IVB diminui significativamente os níveis do VEGF após uma semana do tratamento, com a melhora clínica ocorrendo após um mês. Ao analisarmos 19 moléculas, apesar da diminuição expressiva do VEGF-A, os níveis de sete moléculas pró-angiogênicas aumentaram significativamente após IVB. Não obstante a melhora na espessura da retina ocorrer logo no primeiro mês, a melhora da acuidade visual aconteceu aos dois meses. A combinação de inibição/estimulação de diferentes vias, na tentativa de controlar as complexas interações entre as moléculas relacionadas à angiogênese pode ser um futuro promissor no tratamento da neovascularização ocular. A engenharia genética, em especial o sistema CRISPR, tem potencial para se tornar um importante método no tratamento da DMRI exsudativa.
- ItemEmbargoEngenharia genética de um sistema de expressão duradoura e seletiva do VEGF para condição isquêmica baseado no sistema integrase C31 e HRE(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-05-26) Yasumura, Eduardo Gallatti [UNIFESP]; Han, Sang Won [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Peripheral arterial disease is characterized by insufficient blood flow to the extremities and affects more than 10 million people worldwide and can occur strong pain, non-healing ulcers and loss of limb. With the aim to help these patients, gene therapy has been presented new studies to stimulate the process of neoangiogenesis by injecting genes that encode growth factors. Among the problems used in gene therapy for ischemic diseases, lack of expression of transgenes is the main. Most used vectors, because of the lack of expression levels, can lead to pathological processes of angiogenesis. The ideal vector for this condition would be one who possessed a mechanism of recognition of the ischemic condition to regulate the expression of the transgene and at the same time be integrated into the host cell genome perpetuating their action. Thus, the duration of gene expression would be long enough for the recovery of ischemic tissue and its level would be adjusted as the change in local oxygen concentration. Therefore, this thesis aims to develop a vector that satisfies these conditions using the gene for human vascular endothelial growth factor (hVEGF). To transfer the gene a vector was constructed using the C31 integrase system, which has been shown to mediate a robust and stable integration of the transgene into the genome of the cells. Along with this system, were also inserted the 9 copies of the consensus sequence of hypoxia response element (HRE) in order to control the expression according to oxygen concentration. ELISA, PCR, necrosis degree, determination of muscle force, muscle weigth and immunohistochemistry were performed to evaluate the behavior of the vector and its efficacy in the treatment of ischemia. The results demonstrated the integrative capacity and lasting expression of the vector both in vitro and in vivo. The presence of 9 copies of the HRE sequence, under hypoxia condition, allowed the modulation of gene expression with increased concentration of the protein. These characteristics have resulted in greatly improved in visual appearance of the ischemic limb and became evident the action of hVEGF in terms of increased strength and muscle weigth, decrease of fibrous tissue and increased number of vessels. This study suggests that the joint action of integrase C31 system and HRE may prolong and modulate gene expression in addition to enabling an improvement in treatment for a murine model of limb ischemia.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Identificação e caracterização de promotores foliares de cana-de-açúcar para fins biotecnológicos(Universidade Federal de São Paulo, 2022-07-28) Martins, Alice Loureiro [UNIFESP]; Brito, Michael dos Santos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1357542636768944; http://lattes.cnpq.br/9381119054784288Atualmente, a demanda energética mundial está levando à busca por novas tecnologias de biocombustíveis, como o biodiesel e o bioetanol, a fim de substituir os combustíveis fósseis limitados. O bioetanol tem origem sumariamente vegetal, com a fermentação de açúcares mais acessíveis – como o amido e a sacarose –, advindos de gramíneas (milho e cana-de-açúcar, principalmente); e outros menos usuais, de elevada complexidade, como os de origem lignocelulósica, também conhecidos como etanol de segunda geração (E2G). Tal complexidade se origina da recalcitrância celular, com uma elevada presença de lignina, que impede o acesso à celulose, que é um dos principais alvos para a expansão da produção de bioetanol. Logo, a engenharia genética e a biotecnologia vegetal têm ganho espaço nas pesquisas na área de energias renováveis, de modo a compreender processos envolvidos com o acúmulo de matéria fermentável, mas também a estrutura e a síntese e degradação de elementos da parede celular, em regiões ricas em celulose, para produção de E2G. Dentre as ferramentas genéticas disponíveis, uma das mais relevantes são os promotores, que tem a capacidade de regular a expressão gênica de maneira dúbia, promovendo ou inibindo-a. Além disso, a identificação de promotores para uso na biotecnologia vegetal de monocotiledôneas (especialmente gramíneas) por si só já possui uma grande relevância dado a baixa disponibilidade de promotores efetivos para tal, principalmente com capacidade de regulação tecido-específica. Assim, este trabalho teve como objetivo identificar, caracterizar e amplificar regiões promotoras tecido-específicas de folha de cana-de-açúcar, para futuras aplicações biotecnológicas. Utilizando-se de metodologias in sílico e informações de banco de dados, obteve-se 10 supostos promotores de cana-de-açúcar, milho e sorgo, devidamente caracterizados em relação à sua conservação e sítios de ligação para fatores de transcrição e, através do desenho de primers, também foi possível realizar a amplificação via PCR de fragmentos em cana, que possivelmente correspondem às sequências desejadas. Consequentemente, este trabalho atendeu às expectativas e aos objetivos previamente fixados, e abriu caminho para novos projetos e metodologias voltadas a caracterização molecular e utilização desses promotores para fins biotecnológicos.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Novos promotores constitutivos de cana-de-açúcar: caracterização in silico, isolamento e amplificação(Universidade Federal de São Paulo, 2022-07-29) Silva, Vinícios Henrique [UNIFESP]; Brito, Michael dos Santos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1357542636768944; http://lattes.cnpq.br/8762934035478895A Biotecnologia Vegetal, através do desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas (GMs) possibilita a incorporação de características vantajosas e de interesse em variedades comerciais. No momento onde há uma demanda global por novas fontes renováveis de geração de energia somado ao aumento populacional e a necessidade crescente da produção global de alimentos, as plantas GMs podem contribuir mitigando ou minimizando os impactos ambientais e a expansão das fronteiras agrícolas, através de culturas de maior resistência, produtividade e adaptadas às diferentes condições climáticas e estressoras. Dentre as sequências responsáveis por controlar expressão, momento e local dos genes, os promotores constitutivos, em específico, são responsáveis pela regulação de genes cuja expressão ocorre ininterruptamente nos diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento da planta. Dessa forma, o presente estudo visou caracterizar e avaliar in sílico novos promotores constitutivos da Cana-de-Açúcar (Saccharum spp.), bem como, seus homólogos em Sorgo (Sorghum bicolor) e Milho (Zea mays), para o desenvolvimento de novos vetores de transformação eficientes inicialmente para gramíneas, mas com possibilidade de uso em outras plantas. A partir de banco de dados genômicos e transcriptômicos, específicos para a Cana e espécies correlatas, foram identificados 10 genes constitutivos, cuja expressão foi validada através de ferramentas online, como BAR e Northern Virtual. A partir dessas análises, os genes que codificam: Fator de Alongamento 1 Delta 1, Proteína Homóloga ao Fator de Tradução SUI 1 e Arginina tRNA Ligase da cana-de-açúcar demonstraram os melhores perfis de expressão, quando comparados aos demais genes e à Actina. A partir destes, foram obtidas sequências promotoras, analisados os sítios para ligação de Fatores de Transcrição (FT), bem como presença de regiões conservadas e repetitivas entre elas. Posteriormente, foram desenhados e avaliados primers que por sua vez foram utilizados na amplificação da região promotora dos candidatos através da PCR, cujos resultados foram verificados através de Eletroforese em Gel de Agarose e por fim, foi quantificado a amostra de DNA obtida. Portanto, os objetivos estabelecidos inicialmente pelo estudo foram atingidos, ao mesmo tempo, abrindo possibilidades para estudos posteriores relacionados à caracterização e validação de novos promotores constitutivos para a Engenharia Genética de Plantas.
- ItemSomente MetadadadosscFv de anticorpo monoclonal anti-idiopático 6.C4 mimetiza o antígeno carcinoembrionário in vitro(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2001) Pignatari, Graciela Conceição [UNIFESP]; Han, Sang Won [UNIFESP]Antigeno carcinoembrionario (CEA) e um marcador tumoral para canceres de origem epitelial expresso na maioria dos adenocarcinomas gastrointestinais e e um alvo importante para imunoterapias de cancer. Por ser expresso durante a vida fetal, CEA nao e imunogenico para humanos. Dessa maneira, para possibilitar o seu reconhecimento pelo sistema imunologico, e necessario que mecanismos de tolerancia sejam rompidos. O anticorpo monoclonal anti-idiotipo para CEA, MAb 6.C4, mimetiza a estrutura tridimensional de um epitopo do CEA. Portanto, esse anticorpo ou seus genes podem ser utilizados para a quebra da tolerancia a CEA e, consequentemente, auxiliar no combate ao tumor. Neste trabalho, nos construimos uma molecula de cadeia unica do fragmento variavel, conhecida como scFv (single chain Fv), contendo os genes codificadores das regioes variaveis das cadeias pesada (FVH) e leve (FvL), isolados do hibridoma produtor do Mab 6.C4. O objetivo dessa construcao e demonstrar o funcionamento do gene scFv-6.C4 em bacterias e em celulas de camundongo, visando seu uso para vacina de DNA contra canceres. O produto do gene scFv-6.C4 clonado no vetor pCANTAB5E e expresso em bacterias foi reconhecido por anticorpos especificos ao CEA, MAb 5.D11 e MAb 1.F5H2 por meio de ensaio de competicao. Por immunoblotting, nao foi possivel detectar nenhum sinal, provavelmente devido a alteracao conformacional da scFv6.C4 nas condicoes eletroforeticas. Para expressar a scFv-6.C4 em celulas de mamiferos, nos construimos dois vetores de expressao: pcDNA3/scFv-6.C4 e pcDNA3-PS/scFv-6.C4. Ambos vetores sao derivados do vetor pcDNA3, o qual foi alterado para expressar a scFv-6.C4 intracelularmente ou extracelularmente. Para avaliar o funcionamento destes vetores, nos transfectamos as celulas da linhagem de fibroblasto de camundongo, NIH3T3, com as duas construcoes. A expressao da scFv-6.C4 foi avaliada em nivel de transcricao por RT-PCR e em nivel de traducao por immunoblotting e imunofluorescencia in situ. Por RT-PCR, que nao foi um ensaio quantitativo, pudemos verificar a expressao do gene em ambas as construcoes, utilizando-se os oligonucleotideos especificos...(au)