Engenharia genética de um sistema de expressão duradoura e seletiva do VEGF para condição isquêmica baseado no sistema integrase C31 e HRE
Data
2010-05-26
Autores
Yasumura, Eduardo Gallatti 
Orientadores
Han, Sang Won
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Peripheral arterial disease is characterized by insufficient blood flow to the extremities and affects more than 10 million people worldwide and can occur strong pain, non-healing ulcers and loss of limb. With the aim to help these patients, gene therapy has been presented new studies to stimulate the process of neoangiogenesis by injecting genes that encode growth factors. Among the problems used in gene therapy for ischemic diseases, lack of expression of transgenes is the main. Most used vectors, because of the lack of expression levels, can lead to pathological processes of angiogenesis. The ideal vector for this condition would be one who possessed a mechanism of recognition of the ischemic condition to regulate the expression of the transgene and at the same time be integrated into the host cell genome perpetuating their action. Thus, the duration of gene expression would be long enough for the recovery of ischemic tissue and its level would be adjusted as the change in local oxygen concentration. Therefore, this thesis aims to develop a vector that satisfies these conditions using the gene for human vascular endothelial growth factor (hVEGF). To transfer the gene a vector was constructed using the C31 integrase system, which has been shown to mediate a robust and stable integration of the transgene into the genome of the cells. Along with this system, were also inserted the 9 copies of the consensus sequence of hypoxia response element (HRE) in order to control the expression according to oxygen concentration. ELISA, PCR, necrosis degree, determination of muscle force, muscle weigth and immunohistochemistry were performed to evaluate the behavior of the vector and its efficacy in the treatment of ischemia. The results demonstrated the integrative capacity and lasting expression of the vector both in vitro and in vivo. The presence of 9 copies of the HRE sequence, under hypoxia condition, allowed the modulation of gene expression with increased concentration of the protein. These characteristics have resulted in greatly improved in visual appearance of the ischemic limb and became evident the action of hVEGF in terms of increased strength and muscle weigth, decrease of fibrous tissue and increased number of vessels. This study suggests that the joint action of integrase C31 system and HRE may prolong and modulate gene expression in addition to enabling an improvement in treatment for a murine model of limb ischemia.
A doença arterial periférica é caracterizada pelo fluxo insuficiente de sangue para as extremidades e afeta mais de 10 milhões de pessoas no mundo podendo ocorrer fortes dores, úlceras não-cicatrizantes e perda do membro afetado. Com o intuito de auxiliar esses pacientes, a terapia gênica vem apresentando novos estudos para estimular o processo de neoangiogênese através da injeção de genes que codificam fatores de crescimento. Dentre os problemas da utilização da terapia gênica para doenças isquêmicas, o descontrole de expressão dos transgenes é o principal. A maioria dos vetores utilizados, devido ao descontrole dos níveis de expressão, podem acarretar em processos de angiogênese patológica. O vetor ideal para esta condição seria aquele que possuísse um mecanismo de reconhecimento da condição isquêmica para regular a expressão do transgene e ao mesmo tempo fosse integrado no genoma da célula hospedeira perpetuando sua ação. Desta forma, a duração da expressão gênica seria longa o suficiente para a recuperação do tecido isquêmico e o seu nível seria regulado conforme a variação da concentração de oxigênio local. Portanto, esta tese tem como objetivo principal elaborar um vetor que satisfizesse tais condições utilizando o gene do fator de crescimento endotelial vascular humano (hVEGF). Para transferi-lo foi construído o vetor utilizando o sistema integrase C31, que tem se mostrado capaz de mediar a integração e expressão do transgene no genoma das células de maneira robusta e estável. Junto a esse sistema, foram inseridas também as 9 cópias da seqüência consenso do elemento de resposta à hipóxia (HRE) com o intuito de controlar a expressão de acordo com a concentração de oxigênio. ELISA, PCR, avaliação do grau de necrose, determinação da força e peso muscular e imunohistoquímica foram realizados para avaliar o comportamento do vetor e sua eficácia no tratamento da isquemia. Os resultados demonstraram a capacidade integrativa e de expressão duradoura do vetor tanto in vitro quanto in vivo. A presença das 9 cópias da seqüência HRE, sob condição de hipóxia, possibilitou a modulação da expressão gênica com o aumento da concentração da proteína. Tais características resultaram em grande melhora do aspecto visual do membro isquêmico ficando evidente a ação do hVEGF em termos de aumento da força e massa muscular, diminuição de tecido fibroso e aumento do número de vasos. Este estudo sugere que a ação conjunta dos sistemas integrase C31 e HRE pode prolongar e modular a expressão gênica além de possibilitar uma melhora no tratamento para o modelo murino de isquemia de membro.
A doença arterial periférica é caracterizada pelo fluxo insuficiente de sangue para as extremidades e afeta mais de 10 milhões de pessoas no mundo podendo ocorrer fortes dores, úlceras não-cicatrizantes e perda do membro afetado. Com o intuito de auxiliar esses pacientes, a terapia gênica vem apresentando novos estudos para estimular o processo de neoangiogênese através da injeção de genes que codificam fatores de crescimento. Dentre os problemas da utilização da terapia gênica para doenças isquêmicas, o descontrole de expressão dos transgenes é o principal. A maioria dos vetores utilizados, devido ao descontrole dos níveis de expressão, podem acarretar em processos de angiogênese patológica. O vetor ideal para esta condição seria aquele que possuísse um mecanismo de reconhecimento da condição isquêmica para regular a expressão do transgene e ao mesmo tempo fosse integrado no genoma da célula hospedeira perpetuando sua ação. Desta forma, a duração da expressão gênica seria longa o suficiente para a recuperação do tecido isquêmico e o seu nível seria regulado conforme a variação da concentração de oxigênio local. Portanto, esta tese tem como objetivo principal elaborar um vetor que satisfizesse tais condições utilizando o gene do fator de crescimento endotelial vascular humano (hVEGF). Para transferi-lo foi construído o vetor utilizando o sistema integrase C31, que tem se mostrado capaz de mediar a integração e expressão do transgene no genoma das células de maneira robusta e estável. Junto a esse sistema, foram inseridas também as 9 cópias da seqüência consenso do elemento de resposta à hipóxia (HRE) com o intuito de controlar a expressão de acordo com a concentração de oxigênio. ELISA, PCR, avaliação do grau de necrose, determinação da força e peso muscular e imunohistoquímica foram realizados para avaliar o comportamento do vetor e sua eficácia no tratamento da isquemia. Os resultados demonstraram a capacidade integrativa e de expressão duradoura do vetor tanto in vitro quanto in vivo. A presença das 9 cópias da seqüência HRE, sob condição de hipóxia, possibilitou a modulação da expressão gênica com o aumento da concentração da proteína. Tais características resultaram em grande melhora do aspecto visual do membro isquêmico ficando evidente a ação do hVEGF em termos de aumento da força e massa muscular, diminuição de tecido fibroso e aumento do número de vasos. Este estudo sugere que a ação conjunta dos sistemas integrase C31 e HRE pode prolongar e modular a expressão gênica além de possibilitar uma melhora no tratamento para o modelo murino de isquemia de membro.
Descrição
Citação
YASUMURA, Eduardo Gallatti. Engenharia genética de um sistema de expressão duradoura e seletiva do VEGF para condição isquêmica baseado no sistema integrase C31 e HRE. 2010. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2010.