Navegando por Palavras-chave "NGS"

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    Acesso aberto (Open Access)
    Arranjos de polimorfismos de ncleotídeo Único (SNPa) e sequenciamento de nova geração (NGS) na avaliação e detecção de anormalidades genético-moleculares na leucemia mieloide aguda (LMA)
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-10-04) Noronha, Thiago Rodrigo de [UNIFESP]; Chauffaille, Maria de Lourdes Lopes Ferrari [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7224805785094834; http://lattes.cnpq.br/9155599830008499; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introduction: Acute myeloid leukemia (AML) is the most frequent leukemia in adults and results from somatic genetic lesions on hematopoietic progenitor cells that modify the normal life cycle of cells. The karyotype identifies alterations that support diagnosis, prognosis, treatment option and disease monitoring. However, some cases are normal. Hence, the incorporation of new tests becomes necessary to contemplate all of the genetic alterations. Single nucleotide polymorphism array (SNPa) method, also referred to as molecular karyotyping, is a sensitive technology used to perform high-resolution genome-wide DNA copy number analysis and to detect segmental regions of homozygosity, known as uniparental disomy. Next generation sequencing (NGS) is a methodology that allows simultaneous sequencing of several genes related to the disease. Objectives: Investigate the genetic alterations in patients with AML, at the diagnosis, using the SNPa and NGS methods, in order to evaluate the diagnostic gain of applying these technologies to the clinical routine analysis. Material and methods: Bone marrow samples from 49 cases of AML patients, at diagnosis, were evaluated by karyotype, SNPa and NGS. Results: Karyotype: 15 changed, 20 normal and 14 without metaphase. SNPa: 26 changed and 23 normal. NGS: 37 changed and 12 without detected mutations. The most frequent mutations were in the genes DNMT3A, IDH2, NRAS, FLT3-ITD, TET2, NPM1 e IDH1. Eighteen patients had the prognosis modified, four to favorable and fourteen to poor. Seventeen patients had an unknown or inconclusive integrated prognosis. Conclusion: The SNPa and NGS allowed amplify the detection of genetic alterations in AML in relation to the habitual methods. In summary, these results sustain the use of SNPa and NGS as important tools for AML patients, since offers insights into the molecular pathogenesis, indicating that the prognosis could be further stratified by different mutation combinations. All patients could be reclassified based on genomic status and eighteen had their prognosis modified.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Avaliação por Ngs das mutações de resistência nos genes da integrase, protease e transcriptase reversa do HIV-1 em indivíduos em falha virológica
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-03-15) Duro, Rodrigo Lopes Sanz [UNIFESP]; Komninakis, Shirley Vasconcelos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6529080329230878; http://lattes.cnpq.br/9980376422473815; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introduction: With the introduction of Antiretroviral Therapy, there was an improvement in the quality of life in individuals with Human Immunodeficiency Virus. However, the selective pressure exerted by these drugs had a negative role in the treatment of these individuals, since they could select resistant viral strains that would lead to virological failure. With this, there was a need for the development of new drugs that had a better genetic barrier, capable of withstanding a greater number of mutations, these drugs are now used in salvage therapy. Another much discussed factor is minority mutations, not detected by the Sanger sequencing method, and that may interfere during the individual treatment. For this reason the use of NGS is important since it presents high coverage being able to detect these minority mutations. In this way we can evaluate the presence of majority and minority mutations for the third generation drugs used in salvage therapy. Objective: Evaluate the occurrence of HIV-1 Integrase, Protease and Reverse Transcriptase genes resistance mutations for Darunavir, Etravirine and Raltegravir salvage drugs in samples of HIV-positive patients in ART failure, in the city of São Paulo. Methods: Total of 147 subjects were analyzed, with CD4 <500 cells / mm 3, CV> 3.7 log / mL, age ≥18 years. Reaction Polymerase Chain was performed in the regions of Reverse Transcriptase, Protease and Integrase and was performed Massively Parallel Sequencing of these samples. Results: Mutations for the Integrase region (S147G, N155H and Q148H) were found for the Darunavir associated protein region (I47V, I54L, I84V, L33F, I50V, L33F, V32I, I54M and L76V) and the Reverse Transcriptase associated with Etravirine (L100I, K101P, M230L, Y181C and G190E). Minority resistance were found for the Protease region (M46I, I47V, F53L, I54L, V82A, I84V) for the Reverse Transcriptase region (M41I, K65R, D67N D67G, D67E, K70R, K70E, L74I, V75A, T215Y, K219N, L100I, K101P, K103S, Y188L, Y188S, P225H). Conclusion: Because resistance mutations associated with the Integrase region have been found this may be one of the few cases of transmitted resistance identified to date, since the individual did not use Integrase Inhibitors. The individuals in this study, because they were multi-experimented, had a large presence of mutations that would decrease the effectiveness of the Darunavir and Etravirine drugs even though they presented a greater genetic barrier than the other drugs. The minority mutations identified in this study have been shown to be a concern since mutations that would interfered with the susceptibility to salvage drugs have been identified and the presence of some TAMs has been identified.
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    Development of microsatellite markers using next-generation sequencing for the fish Colossoma macropomum
    (Springer, 2018) Ariede, Raquel Belini; Freitas, Milena Vieira; Hata, Milene Elissa; Mastrochirico-Filho, Vito Antonio; Utsunomia, Ricardo; Mendonça, Fernando Fernandes [UNIFESP]; Foresti, Fausto; Porto-Foresti, Fabio; Hashimoto, Diogo Teruo; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Tambaqui (Colossoma macropomum) is a fish species from the Amazon and Orinoco Rivers, with favorable characteristics to the cultivation system and great market acceptance in South America. However, the construction of a genetic map for the genetic improvement of this species is limited by the low number of molecular markers currently described. Thus, this study aimed to validate gene-associated and anonymous (non-genic) microsatellites obtained by next generation sequencing (RNA-seq and whole genome shotgun-WGS, respectively), for future construction of a genetic map and search for quantitative trait loci (QTL) in this species. In the RNA-seq data, the observed and expected heterozygosity (H-o and H-e) ranged from 0.09 to 0.73, and 0.09 to 0.85, respectively. In the WGS data, H-o and H-e ranged from 0.33 to 0.95, and 0.28 to 0.92, respectively. In general, the evaluation of 200 markers resulted in 45 polymorphic loci, of which 14 were gene-associated (RNA-Seq) and 31 were anonymous (WGS). Moreover, some markers were related to genes of the immune system, biological regulation/control and biogenesis. This study contributes to increase the number of molecular markers available for genetic studies in C. macropomum, which will allow the development of breeding programs assisted by molecular markers.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Investigação de variantes genéticas em indivíduos com a síndrome da deleção 22q11.2 e seu efeito no fenótipo
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-09-15) Nunes Silva, Natalia Rodrigues [UNIFESP]; Melaragno, Maria Isabel de Souza Aranha [UNIFESP]; Dantas, Anelisa Gollo [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5819743679780211; http://lattes.cnpq.br/0678071850781758; http://lattes.cnpq.br/1313423739544412
    A síndrome de deleção 22q11.2 (SD22q11.2) resulta de deleções de segmentos do cromossomo 22 em hemizigose, sendo a síndrome de microdeleção mais frequente observada em humanos. Nossos estudos, assim como outros na literatura, indicam que a síndrome de deleção 22q11.2 resulta em uma ampla variedade de sinais clínicos, como malformações cardíacas congênitas, características faciais típicas, escoliose, imunodeficiência e distúrbios psiquiátricos. Essa heterogeneidade fenotípica apresentada pelos pacientes é observada até mesmo entre membros da mesma família. Apesar de os genes sensíveis à dose localizados na região deletada serem os principais candidatos ao fenótipo, os mecanismos moleculares envolvidos na etiologia da variabilidade fenotípica da síndrome parecem ser mais complexos. Dessa maneira, tem sido sugerido que modificadores genéticos, como as variantes de nucleotídeo único (SNVs, do inglês, single nucleotide variants), fora da região deletada em 22q11.2, poderiam modificar a expressividade do fenótipo. Na presente tese, para uma melhor compreensão de modificadores genéticos envolvidos na heterogeneidade fenotípica da SD22q11.2, foi desenhado um painel de genes composto de nove genes candidatos para a SD22q11.2. Foram sequenciados 60 pacientes brasileiros com a SD22q11.2 e as variantes identificadas foram submetidas à análise in silico que identificou seis variantes deletérias, sendo quatro SNVs e duas indels. Essas variantes foram posteriormente associadas com as características clínicas dos pacientes em que elas foram identificadas, corroborando seu possível papel como modificadores genéticos. Ainda, de forma a se identificar variantes genéticas que influenciam a expressividade de escoliose, característica frequente na SD22q11.2, utilizamos summary statistics de GWAS já disponibilizados pela comunidade cientifica para alimentar modelos de predição de escoliose na SD22q11.2. Também foi avaliado o papel de variantes comuns para o fenótipo de escoliose na população em geral e o papel de variantes associadas a alterações imunológicas não sindrômicas na etiologia da escoliose idiopática. Os achados indicam que a escoliose idiopática compartilha contexto genético com a doença inflamatória de Bowel e Chron, e que é possível predizer a presença de escoliose na nossa coorte brasileira de 98 pacientes com a SD22q11.2 por meio de modelos de aprendizado de máquina treinados em dados de SNP-array de 2.966 pacientes com escoliose idiopática. Dessa forma, foi possível a correlação dos dados obtidos com o fenótipo dos pacientes de forma a se conhecer melhor os fatores genéticos envolvidos na heterogeneidade clínica da SD22q11.2, e ainda, na escoliose idiopática na população em geral
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    Acesso aberto (Open Access)
    Investigação dos genes drivers PTCH1, CTNNB1, DDX3X, TERT e TP53, e a relevância prognóstica de TP53 no meduloblastoma da infância e adolescência : da biologia molecular à clínica
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-06-29) Azevedo, Bruna Mascaro Cordeiro de [UNIFESP]; Toledo, Silvia Regina Caminada de [UNIFESP]; Oliveira, Indhira Dias [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3263440529422712; http://lattes.cnpq.br/8408786810979968; http://lattes.cnpq.br/3098652709219670; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O Meduloblastoma (MB) é um tumor embrionário neuroepitelial do cerebelo, e um dos tumores cerebrais mais frequentes da infância e adolescência. A nova classificação é centrada nos aspectos biológicos, principalmente moleculares, que requerem um manejo terapêutico que respeite esses novos conhecimentos. No presente trabalho, estabelecemos um painel para a identificação de variantes genômicas em genes sabidamente importantes para a tumorigênese do MB. Além disso, foi investigado o comportamento celular e molecular de linhagens celulares de MB expostas ao tratamento com ácido valpróico (AV), um inibidor de desacetilases de histonas (HDACi), sozinho e combinado à cisplatina (CDDP), uma das drogas centrais no tratamento do MB. Para a identificação das variantes genômicas foi utilizada a metodologia de sequenciamento de nova geração (NGS) em 28 amostras tumorais e três linhagens celulares de MB (DAOY, D283MED e ONS-76). Todas as variantes identificadas foram validadas através do software IGV (http://www.broadinstitute.org/igv/), e comparadas com os bancos de dados: dbSNP, 1000 genomes, COSMIC e ExAC. O impacto das variantes foi investigado utilizando os preditores: SIFT, PolyPhen, e Mutation Taster. Foram observadas mutações e variantes de significado incerto (VUS) em uma média de 15 variantes/amostra, em todos os genes investigados por NGS. O gene PTCH1 apresentou o maior número de variantes/amostra. O gene CTNNB1 apresentou duas mutações no éxon 3, já descritas para o MB. O gene DDX3X apresentou apenas duas mutações classificadas como patogênicas. Os genes TERT e TP53 apresentaram sete e seis variantes exônicas, respectivamente, e para o gene TP53, observamos a presença de um polimorfismo (c.C215G:pP72R) em 74% das amostras. As quatro amostras portadoras de mutações em TP53, apresentaram concomitantemente mutações de PTCH1. A progressão de doença observada nos pacientes portadores dessas mutações concomitantes, corrobora com a recente estratificação de risco proposta. As três linhagens celulares de MB utilizadas neste estudo foram autenticadas por STR (Short Tandem Repeat), utilizando o kit de identificação GlobalFiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems™/ThermoFisher Scientific®), apresentando índice de correspondência (IC) maior de 90%. As linhagens celulares foram submetidas a três regimes de tratamento: apenas com AV, apenas com CDDP, e AV e CDDP combinados. Após tratadas, as células foram avaliadas quanto a viabilidade, citotoxicidade, migração e invasão. Também foi realizada a investigação da expressão de genes relacionados ao processo tumorigênico do MB, por qRT-PCR, e analisado o perfil de metilação e acetilação, por Western Blott, nesses grupos de células. Na linhagem DAOY, o tratamento com CDDP foi o único significantemente eficaz em reduzir a viabilidade celular (p<0,0001). Já para as linhagens D283MED e ONS-76, o tratamento combinado foi mais eficaz em reduzir a viabilidade (p<0,0001). Devemos ressaltar que as linhagens D283MED e ONS-76, não apresentam mutação em TP53, o que deve interferir na resposta ao tratamento. Os níveis de expressão dos genes AKT, GLI1 e TERT, nas linhagens D283MED e ONS-76 tratadas com AV, isolado ou combinado, estavam significantemente aumentados (p<0.0001) quando comparados com os outros grupos de tratamento. No presente estudo observamos, que em linhagens celulares representativas de MB, a presença de mutação de TP53 é fator importante na resposta ao tratamento; o AV não colabora com a indução de morte celular nas células onde o gene TP53 está mutado; as células que sobrevivem ao tratamento com AV tem um potencial proliferativo aumentado e, genes centrais nas vias envolvidas com o processo de tumorigênese do MB, apresentam expressão significantemente maior do que o controle após tratamento com AV, evidenciando que o tratamento com AV deve ser considerado com atenção em pacientes com MB; a investigação de mutação do gene TP53 deve ser realizada para os pacientes com MB, para garantir a correta estratificação de risco; a frequência e a distribuição das mutações descritas em genes drivers no MB, merecem mais investigações em amostras de MB.