Navegando por Palavras-chave "Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real"

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    Desenvolvimento de PCR em tempo real para detecção rápida de Escherichia coli diarreiogênica
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2012) Souza, Tamara Barros de [UNIFESP]; Scaletsky, Isabel Cristina Affonso [UNIFESP]
    Introdução: no Brasil, as Escherichia coli ainda estao entre as causas mais importantes de diarreia aguda particularmente em criancas. Com os conhecimentos biologicos, clinicos e epidemiologicos mais aprofundados, foram estabelecidos seis patotipos diferentes de E. coli diarreiogenica (DEC): E. coli enteropatogenica (EPEC), E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora de toxinas de Shiga (STEC) ou E. coli enterohemorragica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC). A identificacao dos diferentes patotipos representa um desafio, pois o uso de apenas testes bioquimicos e provas sorologicas nao sao suficientes na deteccao de alguns patotipos. Objetivo: avaliar o desempenho da tecnica da PCR em tempo real para o diagnostico de infeccoes por DEC visando a sua utilizacao na rotina laboratorial. Resultados: inicialmente, foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real para a deteccao simultanea dos seis patotipos de DEC, e subdivisao de EPEC em tipica e atipica, utilizando o sistema de deteccao SYBR®Green. Este ensaio utiliza nove conjuntos de primers especificos para as sequencias geneticas: eae e pEAF de EPEC, aatA de EAEC, afaBC de DAEC, elt e est de ETEC, ipaH de EIEC e stx1 e stx2 de STEC em uma unica reacao. Posteriormente um segundo ensaio foi desenvolvido para deteccao dos patotipos mais frequentes em nosso meio, EPEC, EAEC e DAEC. Neste ensaio foi escolhido o sistema de deteccao TaqMan® e quatro conjuntos de primers/sondas para detectar a presenca das sequencias geneticas eae e pEAF de EPEC, aatA de EAEC e afaBC de DAEC. Em seguida, a especificidade dos ensaios foi avaliada em amostras comprovadas de DEC, amostras de E. coli nao patogenicas e amostras de outras enterobacterias. Todas as amostras de DEC e de Shigella spp. emitiram sinal de fluorescencia forte e positivo. A sensibilidade foi determinada com as amostras prototipo, e o limite de deteccao foi de aproximadamente 102UFC/mL; em amostras de fezes nao diarreicas inoculadas com diferentes concentracoes de amostras prototipo de DEC, os limites de deteccao variaram de 2,5x107 a 4,5x105UFC/ml por grama de fezes nos ensaios de PCR TaqMan® e PCR SYBR®Green. A aplicacao das PCRs em tempo real foi realizada em amostras de E. coli isoladas das fezes de 97 criancas Quilombolas com diarreia e 285 criancas controle do Espirito Santo, e os resultados comparados com os de PCR convencional e hibridizacao de colonias. Houve total concordancia entre os resultados obtidos com ambos os ensaios, entretanto a PCR SYBR®Green detectou 52 amostras a mais que a PCR convencional e a PCR TaqMan® detectou 96 a mais que a hibridizacao de colonias mas nao identificou 7 amostras. O calculo de coeficiente de Kappa mostrou forte correlacao (0,81) entre a PCR SYBR®Green e a PCR convencional e boa correlacao (0,61) entre a PCR TaqMan® e o teste de hibridizacao de colonias. Conclusao: nossos ensaios de PCR em tempo real oferecem possibilidade de uma rapida e sensivel identificacao simultanea dos diferentes patotipos de DEC, podendo ser utilizados em laboratorios clinicos e de pesquisa
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    Efeitos da indução da heme oxigenase-1 em animais submetidos ao modelo de epilepsia do lobo temporal por modelo pilocarpina
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2012) Avanzi, Renata Della Torre [UNIFESP]; Covolan, Luciene [UNIFESP]
    A epilepsia do lobo temporal e uma doenca cuja caracteristica anatomopatologicamais frequente e a esclerose hipocampal. O modelo animal da pilocarpina mimetiza a epilepsia do lobo temporal de humanos e tem o Status epilepticus ou SE como deflagrador das crises espontaneas recorrentes. Enquanto o SE provoca intensa perda neuronal e gliose em diversas estruturas cerebrais, particularmente no hipocampo, as crises produzem apenas lesoes em um pequeno numero de celulas. O dano tecidual final e resultado de um fino balanco entre a agressao e a capacidade do orgao de se proteger atraves de uma resposta citoprotetora. Embora haja controversias a respeito da atividade da enzima heme oxigenase-1, ela e um exemplo de proteina com atividade citoprotetora e antiinflamatoria. O presente estudo teve como objetivo principal avaliar os efeitos (protecao/dano celular) da atividade da enzima nas camadas celulares do CA1, CA3 e giro denteado do hipocampo de ratos submetidos ao SE do modelo da pilocarpina. Ratos Wistar machos foram tratados com a droga hemin 24h antes ou 90 min apos o SE e posteriormente sacrificados nos periodos 2,5h, 6h e 24h apos o SE. O hemin e um substrato natural da heme oxigenase-1, atuando como indutor da expressao da enzima, pois ela se constitui em baixos niveis em condicoes normais. A eficacia da inducao da enzima e os niveis de RNAm nos extratos hipocampais foram verificados atraves da tecnica de PCR-RT. Alem disso, o metodo de degeneracao neuronal Fluoro-Jade B foi utilizado para avaliar os efeitos da inducao da enzima sobre o padrao de lesao celular nas camadas de CA1, CA3 e giro denteado do hipocampo de animais submetidos ao SE que receberam ou nao o tratamento com hemin
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    Identificacao molecular e analise filogenetica das especies do complexo Candida parapsilosis utilizando genes mitocondriais
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2012) Souza, Ana Carolina Remondi [UNIFESP]
    Candida parapsilosis e a segunda especie de Candida mais frequentemente isolada de infeccoes de corrente sanguinea na America do Sul e em alguns paises europeus, como a Espanha e a Italia. Desde 2005, essa especie tem sido considerada um complexo de tres especies proximas: C. parapsilosis (sensu stricto), Candida metapsilosis e Candida orthopsilosis. Nesse trabalho descrevemos um ensaio para a identificacao dessas especies baseado na tecnologia de TaqMan de PCR em tempo real utilizando DNA mitocondrial (mtDNA) como alvo. Inicialmente, utilizamos ferramentas da genomica comparativa para localizar regioes sintenicas entre genomas mitocondriais das tres especies e, entao, selecionamos o gene NADH5 como alvo para a PCR e para as inferencias filogeneticas. As sondas foram desenhadas baseadas em uma combinacao de diferentes polimorfismos de unica base (SNPs) capazes de diferenciar cada especie do complexo C. parapsilosis. A metodologia proposta foi testada, em estudo piloto, em 4 cepas referencia e 5 isolados clinicos utilizando, primeiramente, mtDNA como template e em seguida, DNA genomico. Para validacao, usamos um total de 100 isolados clinicos de C. parapsilosis (sensu lato), incluindo: 66 cepas originarias de diferentes regioes geograficas do Brasil, 30 isolados provenientes da Espanha utilizados como braco cego do estudo e 4 cepas da American Type Culture Collection (ATCC). Alem disso, foram utilizados como controle negativo, 6 cepas de especies nao pertencentes ao complexo C. parapsilosis. A partir de DNA genomico a PCR em tempo real foi capaz de diferenciar as 3 especies com 100% de acuracia, nao sendo observada amplificacao quando DNA de outras especies foi usado como template. Alem disso, o metodo apresentou 100% de concordancia com as identificacoes geradas pelo sequenciamento da regiao ITS. Em relacao a divergencia evolutiva das especies do complexo C. parapsilosis nos sequenciamos uma porcao do gene NADH5 de 18 isolados e as sequencias geradas foram utilizadas para a construcao das arvores filogeneticas. Estas apontaram que, para o gene NADH5, C. metapsilosis se caracteriza como a especie basal e, portanto, pode-se sugerir que esta seja a especie progenitora. As analises de entropia mostraram que o gene NADH5 e conservado e parece estar sob acao da deriva genetica, sendo este o fenomeno responsavel pelo processo de especiacao que as especies C. parapsilosis (sensu stricto), C. orthopsilosis e C. metapsilosis estao passando. Alem disso, embora nossos dados apontem que a especie C. metapsilosis seja a especie ancestral, os valores de entropia e teste de selecao obtidos bem como estudos filogeneticos previos da literatura mostram que a divergencia evolutiva das 3 especies pertencentes ao complexo nao e possivel de ser avaliada uma vez que elas podem ser resultado de uma politomia real (hard politomy). Nosso trabalho e o primeiro a descrever um metodo molecular baseado no sistema TaqMan de PCR em tempo real, utilizando o gene mitocondrial NADH5, para a identificacao rapida e acurada das tres especies do complexo C. parapsilosis. Alem de conomizar tempo, quando comparado com o sequenciamento, a metodologia proposta constitui uma ferramenta valiosa para estudos clinicos e epidemiologicos sobre estas especies emergentes
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    Acesso aberto (Open Access)
    Oxidative stress gene expression profile in inbred mouse after ischemia/reperfusion small bowel injury
    (Sociedade Brasileira para o Desenvolvimento da Pesquisa em Cirurgia, 2012-11-01) Bertoletto, Paulo Roberto; Ikejiri, Adauto Tsutomu; Somaio Neto, Frederico; Chaves, José Carlos; Teruya, Roberto; Bertoletto, Eduardo Rodrigues; Taha, Murched Omar [UNIFESP]; Fagundes, Djalma José [UNIFESP]; UFGD Medical School; Federal University of Mato Grosso do Sul; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    PURPOSE: To determine the profile of gene expressions associated with oxidative stress and thereby contribute to establish parameters about the role of enzyme clusters related to the ischemia/reperfusion intestinal injury. METHODS: Twelve male inbred mice (C57BL/6) were randomly assigned: Control Group (CG) submitted to anesthesia, laparotomy and observed by 120min; Ischemia/reperfusion Group (IRG) submitted to anesthesia, laparotomy, 60min of small bowel ischemia and 60min of reperfusion. A pool of six samples was submitted to the qPCR-RT protocol (six clusters) for mouse oxidative stress and antioxidant defense pathways. RESULTS: On the 84 genes investigated, 64 (76.2%) had statistic significant expression and 20 (23.8%) showed no statistical difference to the control group. From these 64 significantly expressed genes, 60 (93.7%) were up-regulated and 04 (6.3%) were down-regulated. From the group with no statistical significantly expression, 12 genes were up-regulated and 8 genes were down-regulated. Surprisingly, 37 (44.04%) showed a higher than threefold up-regulation and then arbitrarily the values was considered as a very significant. Thus, 37 genes (44.04%) were expressed very significantly up-regulated. The remained 47 (55.9%) genes were up-regulated less than three folds (35 genes - 41.6%) or down-regulated less than three folds (12 genes - 14.3%). CONCLUSION: The intestinal ischemia and reperfusion promote a global hyper-expression profile of six different clusters genes related to antioxidant defense and oxidative stress.