O impacto da mutação no gene LIPL-5 sobre a expressão da enzima Lipase-like 4 e resposta ao estresse em Caenorhabditis elegans
Data
2021
Autores
Assis, Carolina Gomes De 
Orientadores
Cunha, Fernanda Marques Da
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Introduction: Mitochondria are important organelles for the organism, as they are involved in several physiological processes crucial to the maintenance of homeostasis. In a study conducted previously by our group, it was observed that C. elegans with a loss-of-function mutation for the enzyme Lipase-Like 5 (LIPL-5) presented lipid profile alterations including increased amounts of ceramides and mitochondrial signature lipids. It was also observed that the mitochondria of these mutants had improved oxidative capacity when compared to mitochondria from wild type animals. However, the mechanisms by which LIPL-5 deficiency modulates the mitochondrial phenotype are unknown. Objective: To investigate the impact of the lipl-5 gene mutation on the expression of the enzyme Lipase-Like 4 (LIPL-4) and on the unfolded protein response (UPR) in C. elegans. Methods: To analyze the cytoplasmic UPR, a reporter strain mutant for lipl-5 was generated by crossing. For mitochondrial UPR and endoplasmic reticulum UPR, the lipl-5 gene was silenced by RNAi in the respective reporter strains. The activation of stress responses was assessed by fluorescence microscopy followed by quantification. Silencing was confirmed by qPCR, a method that was also used to assess the impact of LIPL-5 deficiency on lipl-4 relative expression, under conditions of bacterial deprivation and ad libitum. Results: lipl-5 silencing in the reporter animals for mitochondrial UPR resulted in a significant increase in the mean fluorescence intensity, indicating activation of UPRmt. lipl-5 silencing in the reporter animals for endoplasmic reticulum UPR, by itself, did not cause UPRer activation in basal conditions, but it impaired its activation in response to tunicamycin (TM) treatment. lipl-5 gene mutation did not provoke a stress response in the cytoplasm under baseline conditions nor significantly affected the response of the animals when challenged with heat shock. Regarding the impact of LIPL-5 deficiency on lipl-4 expression, when evaluating the expression of lipl-4 and lipl-5 in wild type animals (WT), it was seen that both are expressed in response to bacterial deprivation, but with different expression profiles. When investigating lipl-4 expression in lipl-5 mutants, it was possible to observe that, after 6 hours of bacterial deprivation, relative levels of lipl- 4 in the mutant were considerably higher than in WT, but without significant difference after 24 h of starvation. There was also no difference in lipl-4 expression levels in lipl-5 animals in ad libitum condition compared to WT. Conclusions: LIPL- 5 deficiency per se activates mitochondrial UPR, and impairs the response to endoplasmic reticulum UPR induced by TM. The effect of the absence of LIPL-5 is specific since the cytoplasmic UPR is not affected by its deficiency. The lack of LIPL- 5 does not affect lipl-4 expression in control conditions, but induces an early and intense increase in the lipl-4 expression in response to bacterial deprivation. The effects of LIPL-5 deficiency on UPRmt, UPRer and lipl-4 expression may be involved in mitochondrial phenotype alterations previously reported in lipl-5 animals.
Introdução: As mitocôndrias são organelas importantes para o organismo, pois estão envolvidas em diversos processos fisiológicos cruciais para a manutenção da homeostase. Em trabalho realizado anteriormente pelo grupo, foi observado que C. elegans com perda de função para a enzima Lipase-Like 5 (LIPL-5) apresentava alterações no perfil lipídico incluindo maiores quantidades de ceramidas e lipídios mitocondriais. Também foi observado que as mitocôndrias destes mutantes possuíam maior capacidade oxidativa quando comparadas às mitocôndrias de animais selvagens. No entanto, os mecanismos pelos quais a deficiência de LIPL- 5 modula o fenótipo mitocondrial são desconhecidos. Objetivo: Investigar o impacto da mutação no gene lipl-5 sobre a expressão da enzima Lipase-Like 4 (LIPL-4) e sobre as respostas ao estresse em C. elegans. Métodos: Para analisar a resposta ao estresse citoplasmático, foi gerada, por meio de cruzamento, uma linhagem repórter de estresse de citoplasma mutante para lipl-5. Para análise das respostas ao estresse na mitocôndria e retículo endoplasmático, o gene lipl-5 foi silenciado por meio de RNAi em linhagens repórteres de estresse nos compartimentos celulares de interesse. A ativação das respostas ao estresse foi avaliada por microscopia de fluorescência seguida de quantificação. O silenciamento foi confirmado por qPCR, método que também foi utilizado para avaliar o impacto da deficiência de LIPL-5 sobre a expressão de lipl-4, em condições de privação alimentar e ad libitum. Resultados: O silenciamento de lipl- 5 nos animais repórteres para estresse mitocondrial causou um aumento significativo na intensidade de fluorescência, indicando ativação da UPRmt. Já o silenciamento de lipl-5 nos animais repórteres de estresse de retículo, por si só, não ativou a resposta ao estresse, no entanto prejudicou a ativação da UPRer quando em situação de estresse causado por tunicamicina (TM). A mutação no gene lipl-5 não provocou resposta a estresse no citoplasma em condições basais e também não afetou de forma significativa a resposta dos animais quando desafiados com choque térmico. Quanto ao impacto da deficiência de LIPL-5 sobre a expressão de lipl-4, ao avaliar a expressão de lipl-4 e lipl-5 nos animais selvagens (WT), foi visto que ambos são expressos em resposta a privação alimentar, porém com perfis de expressão diferentes. Ao investigar a expressão de lipl-4 nos mutantes lipl-5 observamos que, após 6 horas de privação alimentar, os níveis de lipl-4 no mutante eram consideravelmente maiores do que em WT, porém sem diferença significativa após 24 h de dieta. Também não houve diferença nos níveis de expressão de lipl- 4 nos animais WT e lipl-5 em dieta ad libitum. Conclusões: A deficiência de lipl-5 per se ativa a resposta ao estresse mitocondrial, e prejudica a resposta ao estresse de retículo induzido pela exposição a TM. O efeito da ausência de LIPL-5 é específico uma vez que a resposta a estresse de citoplasma não é afetada por sua deficiência. A falta de LIPL-5 não afeta a expressão de lipl-4 em condição controle, mas induz um aumento precoce e intenso na expressão de lipl-4 em resposta à privação alimentar. As alterações promovidas pela deficiência de LIPL-5 sobre a UPRmt, UPRer e expressão de lipl-4 podem estar envolvidas nas alterações de fenótipo mitocondrial observadas no mutante lipl-5 em trabalho anterior.
Introdução: As mitocôndrias são organelas importantes para o organismo, pois estão envolvidas em diversos processos fisiológicos cruciais para a manutenção da homeostase. Em trabalho realizado anteriormente pelo grupo, foi observado que C. elegans com perda de função para a enzima Lipase-Like 5 (LIPL-5) apresentava alterações no perfil lipídico incluindo maiores quantidades de ceramidas e lipídios mitocondriais. Também foi observado que as mitocôndrias destes mutantes possuíam maior capacidade oxidativa quando comparadas às mitocôndrias de animais selvagens. No entanto, os mecanismos pelos quais a deficiência de LIPL- 5 modula o fenótipo mitocondrial são desconhecidos. Objetivo: Investigar o impacto da mutação no gene lipl-5 sobre a expressão da enzima Lipase-Like 4 (LIPL-4) e sobre as respostas ao estresse em C. elegans. Métodos: Para analisar a resposta ao estresse citoplasmático, foi gerada, por meio de cruzamento, uma linhagem repórter de estresse de citoplasma mutante para lipl-5. Para análise das respostas ao estresse na mitocôndria e retículo endoplasmático, o gene lipl-5 foi silenciado por meio de RNAi em linhagens repórteres de estresse nos compartimentos celulares de interesse. A ativação das respostas ao estresse foi avaliada por microscopia de fluorescência seguida de quantificação. O silenciamento foi confirmado por qPCR, método que também foi utilizado para avaliar o impacto da deficiência de LIPL-5 sobre a expressão de lipl-4, em condições de privação alimentar e ad libitum. Resultados: O silenciamento de lipl- 5 nos animais repórteres para estresse mitocondrial causou um aumento significativo na intensidade de fluorescência, indicando ativação da UPRmt. Já o silenciamento de lipl-5 nos animais repórteres de estresse de retículo, por si só, não ativou a resposta ao estresse, no entanto prejudicou a ativação da UPRer quando em situação de estresse causado por tunicamicina (TM). A mutação no gene lipl-5 não provocou resposta a estresse no citoplasma em condições basais e também não afetou de forma significativa a resposta dos animais quando desafiados com choque térmico. Quanto ao impacto da deficiência de LIPL-5 sobre a expressão de lipl-4, ao avaliar a expressão de lipl-4 e lipl-5 nos animais selvagens (WT), foi visto que ambos são expressos em resposta a privação alimentar, porém com perfis de expressão diferentes. Ao investigar a expressão de lipl-4 nos mutantes lipl-5 observamos que, após 6 horas de privação alimentar, os níveis de lipl-4 no mutante eram consideravelmente maiores do que em WT, porém sem diferença significativa após 24 h de dieta. Também não houve diferença nos níveis de expressão de lipl- 4 nos animais WT e lipl-5 em dieta ad libitum. Conclusões: A deficiência de lipl-5 per se ativa a resposta ao estresse mitocondrial, e prejudica a resposta ao estresse de retículo induzido pela exposição a TM. O efeito da ausência de LIPL-5 é específico uma vez que a resposta a estresse de citoplasma não é afetada por sua deficiência. A falta de LIPL-5 não afeta a expressão de lipl-4 em condição controle, mas induz um aumento precoce e intenso na expressão de lipl-4 em resposta à privação alimentar. As alterações promovidas pela deficiência de LIPL-5 sobre a UPRmt, UPRer e expressão de lipl-4 podem estar envolvidas nas alterações de fenótipo mitocondrial observadas no mutante lipl-5 em trabalho anterior.