Estudo cinético da oligopeptidase A (OpdA) de Escherichia coli e determinação da importância do resíduo Tyr607 para sua atividade catalítica

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dc.contributor.advisorCarmona, Adriana Karaoglanovic [UNIFESP]
dc.contributor.authorLorenzon, Ricardo Zamprogno [UNIFESP]
dc.contributor.institutionUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
dc.date.accessioned2015-07-22T20:50:04Z
dc.date.available2015-07-22T20:50:04Z
dc.date.issued2010-03-31
dc.description.abstractOligopeptidase A (OpdA) belongs to the M3A subfamily of bacterial peptidases with catalytic and structural properties similar to mammalian thimet-oligopeptidase (TOP) and neurolysin (NEL). The three enzymes have four conserved Tyr residues on a flexible loop in close proximity to the catalytic site. In OpdA, the flexible loop is formed by residues 600 to 614 (600SHIFAGGYAAGYYSY614). Modeling studies indicated that in OpdA the Tyr607 residue might be involved in the recognition of the substrate with a key role in catalysis. Two mutants were constructed replacing Tyr607 by Phe (Y607F) or Ala (Y607A) and the influence of the site-directed mutagenesis in the catalytic process was examined. The hydrolysis of Abz-GXSPFRQ-EDDnp derivatives (Abz = ortho-aminobenzoic acid; EDDnp N-[2,4-dinitrophenyl]-ethylenediamine; X = different amino acids) was used to compare the activities of wild type OpdA and those of Y607F and Y607A mutants. The results indicated that the wild-type enzyme cleaved all the peptides only on the X-S bond whereas the Y607F and Y607A mutants were able to hydrolyze both the X-S and the P-F bonds. The kinetic parameters showed the importance of Tyr607 in OpdA catalytic activity as its substitution promoted a decrease in the kcat/Km value of about 100-fold with Y607F mutant and 1000-fold with Y607A. Both mutations, however, did not affect protein folding as indicated by CD and intrinsic fluorescence analysis. Results indicate that the OpdA Tyr607 residue plays an important role in the enzyme-substrate interaction and in the hydrolytic activity.en
dc.description.abstractOligopeptidase A (OpdA) é uma peptidase bacteriana membro da subfamília M3A que apresenta propriedades catalíticas e estruturais semelhantes às das peptidases de mamífero thimet-oligopeptidase (TOP) e neurolisina (NEL). As três enzimas apresentam quatro resíduos de tirosina conservados presentes na alça flexível que se encontra próxima ao centro ativo da enzima. Na OpdA, a alça flexível é formada pelos resíduos 600 a 614 (600SHIFAGGYAAGYYSY614). Na primeira etapa do trabalho fizemos a modelagem da OpdA tendo como base a estrutura cristalográfica da dipeptil carboxipeptidase de E.coli (Dcp). Os resultados indicaram que o resíduo Tyr607 da OpdA pode estar envolvido no reconhecimento do substrato, tendo uma grande importância na catálise enzimáticas. Assim, construímos dois mutantes da OpdA substituindo a Tyr607 por Phe (Y607F) e por Ala (Y607A) e examinamos a influência desta mutação sitio dirigida no processo catalítico. A hidrólise dos substratos derivados da sequencia Abz-GXSPFRQ-EDDnp (Abz = ácido orto-aminobenzóico; EDDnp = N- [2,4-dinitrofenil]-etilenodiamino; X = diferentes aminoácidos) pela OpdA wild type e pelas mutantes Y607F e Y607A foi sistematicamente estudado. Os resultados indicaram que enzima wild type clivou todos os peptídeos exclusivamente na ligação X-S enquanto que a Y607F e a Y607A hidrolisaram tanto a ligação X-S quanto a P-F. Os parâmetros cinéticos mostraram a importância da Tyr607 da OpdA para atividade catalítica, uma vez que sua substituição promoveu a diminuição nos valores de kcat/Km de até 100 vezes para a mutante Y607F e de até 1000 vezes para a mutante Y607A. No entanto, a mutação não afetou a conformação estrutural da proteína, como indicado pelas análises de CD e fluorescência intrínseca. Os resultados cinéticos confirmaram que o resíduo Tyr607 da OpdA tem importante papel na interação enzima-substrato e na atividade hidrolítica.pt
dc.description.sourceTEDE
dc.description.sourceBV UNIFESP: Teses e dissertações
dc.format.extent58 p.
dc.identifier.citationLORENZON, Ricardo Zamprogno. Estudo cinético da oligopeptidase A (OpdA) de Escherichia coli e determinação da importância do resíduo Tyr607 para sua atividade catalítica. 2010. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2010.
dc.identifier.fileRetido-011.pdf
dc.identifier.urihttp://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9495
dc.language.isopor
dc.publisherUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/restrictedAccess
dc.subjectFamília M3Apt
dc.subjectE. coli oligopeptidasept
dc.subjectMutaçãopt
dc.subjectSubstratospt
dc.subjectEscherichia colipt
dc.subjectM3A familyen
dc.subjectE. coli oligopeptidaseen
dc.subjectMutationen
dc.subjectSubstratesen
dc.subjectEscherichia colien
dc.titleEstudo cinético da oligopeptidase A (OpdA) de Escherichia coli e determinação da importância do resíduo Tyr607 para sua atividade catalíticapt
dc.title.alternativeKinetic study of oligopeptidase A (OPDA) from Escherichia coli and determination of the importance of residue Tyr607 to its catalytic activityen
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/masterThesis
unifesp.campusSão Paulo, Escola Paulista de Medicina (EPM)
unifesp.graduateProgramCiências Biológicas (Biologia Molecular)
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