Papel da caspase-3 na quiescência dos gonócitos de ratos
Data
2019-01-31
Autores
Santos, Marina Nunes Dos 
Orientadores
Teixeira, Taiza Stumpp
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
The germ cell lineage arises from a progenitor cell population in the epiblast called primordial germ cells (PGC). These cells erase their somatic program and enter a germ cell program after what they migrate to the gonads through the gut endoderm and their dorsal mesentery. During their migration and just after they enter the gonadal ridges, the male PGC proliferate for a short period and then enter in quiescence. These cells are then called gonocytes. Because gonocytes are quiescent cells, very few studies about them are available, so that the mechanisms of the quiescence establishment and regulation are not well known. Studies by our group showed that rat gonocytes are mitotic until 18 days post coitum (dpc) and enter in quiescence at 19dpc. During this period, they stay arrested in G0/G1 and no death or proliferation is observed. Our group also showed very abundant and intense caspase-3 (Casp3) labeling in the cytoplasm of all gonocytes, suggesting that this enzyme may play a non-apoptotic role during rat gonocyte quiescence. In addition, there is evidence that Casp3 cleaves the pluripotent marker NANOG in embryonic stem cells, which is also expressed by the male germ cells. Aim: The aim of this study was to investigate if Casp3 and NANOG interact and whether the inhibition of Casp3 activity leads to alterations of the expression of cell cycle genes in the quiescent gonocyte. Methods: For this, 19dpc testis were collected, dissociated and the isolated gonocytes were incubated in vitro with Casp3 inhibitor for 24h. The expression of cell cycle, apoptosis and pluripotency markers was analyzed by qPCR. Gonocyte viability was investigated by propidium iodide and flow cytometry. Protein extraction was performed from whole 19dpc testes for the investigation of Casp3 and NANOG protein expression. Results: The analysis of gonocyte viability showed that the cultures treated with Casp3 inhibitor presented more dead gonocytes than the control cultures. The inhibition of Casp3 also lead to an increase of Pcna expression as well as a decrease of p21cip, p27kip, Bcl2 and Kras expression. When compared with gonocytes that were not maintained in culture for 24h, the cultured gonocytes showed an increase of p21cip expression in control and treated cultures and of p27kip in the control cultures. The expression of Sox2 and Nanog was not detected in the cultured gonocytes, although Sox2 have been detected in non-cultured gonocytes. Casp3 protein was detected in 19dpc testis extract, although NANOG protein was not detected. Conclusion: The results obtained here lead us to conclude that Casp3 inhibition affects the expression of classical cell cycle markers, suggesting that this enzyme plays a non-apoptotic role in male germ cell development by controlling the cell cycle.
Nos seres humanos e mamíferos em geral, a linhagem germinativa origina-se a partir de uma população de células progenitoras, chamadas células germinativas primordiais (CGP), as quais segregam da linhagem somática, na região do epiblasto, durante as fases iniciais da embriogênese. Logo após a especificação, as CGP iniciam um processo de migração através do endoderma do intestino primitivo posterior e do seu mesentério dorsal, migrando bilateralmente para as cristas gonadais em desenvolvimento. Durante e após a migração, as CGP proliferam e aumentam rapidamente sua população. Após esse período, na gônada masculina, as células germinativas sofrem parada do ciclo celular, iniciando um período de quiescência, e passam a ser chamadas de gonócitos. Por se encontrarem em quiescência, os gonócitos são pouco estudados, de forma que os mecanismos de regulação e o estabelecimento da quiescência das células germinativas e a retomada do ciclo celular não são totalmente esclarecidos. Estudos realizados pelo nosso grupo demonstram que os gonócitos realizam mitoses consecutivas até o 18dpc (dia pós-coito), em ratos, sendo que aos 19dpc todos se encontram quiescentes. Durante este período, os gonócitos permanecem na fase G0/G1 do ciclo celular, não havendo alteração do seu número ou morte por apoptose. Estudos anteriores também realizados pelo nosso grupo identificaram, em gonócitos quiescentes de ratos, que a presença de expressão proteica de Caspase-3 (Casp3) parece ser independente da sua função apoptótica e apresenta um padrão de localização semelhante ao da proteína NANOG. Além disso, evidências em células-tronco embrionárias também sugerem que a ativação da Casp3 esteja associada à clivagem de fatores de pluripotência, como o Nanog. Objetivo: Desta forma, o objetivo deste estudo é investigar se existe interação entre Casp3 e NANOG e se a inibição da atividade de Casp3 pode levar a alterações na expressão de marcadores do ciclo celular dos gonócitos em quiescência. Métodos: Testículos embrionários de ratos foram coletados aos 19dpc, os gonócitos foram isolados e mantidos em cultura com inibidor da atividade de Casp3. A expressão de genes envolvidos com o controle do ciclo celular e pluripotência foi analisada através da técnica de PCR em tempo real. A análise da viabilidade dos gonócitos em cultura foi observada através da Citometria de Fluxo, sendo os gonócitos marcados com iodeto de propídio. A expressão proteica de NANOG e Casp3 também foi investigada em testículos de 19dpc. Resultados: A análise da viabilidade, surpreendentemente demonstrou aumento no número de células apoptóticas nas culturas tratadas com inibidor da atividade de Casp3, quando comparadas com as culturas controles. Referente à avaliação da presença de marcadores do ciclo celular dos gonócitos em cultura, foi possível observar que as culturas tratadas apresentaram diminuição na expressão dos marcadores Bcl2, Kras, p21cip e p27kip e aumento de Pcna. Além disso, as culturas foram comparadas à expressão de gonócitos que não passaram pelas 24 horas de cultura, em que se observou um aumento da expressão de p21cip e p27kip, em ambas as culturas e de p27kip nas culturas controles. Os marcadores de pluripotência, Sox2 e Nanog, não foram detectados in vitro, embora Sox2 tenha sido detectado nos gonócitos que não passaram pelas 24 horas de cultura. Conclusão: Os dados obtidos indicam que a inibição da proteína Casp3 afeta a expressão de marcadores clássicos do ciclo celular, sugerindo que a Casp3 desempenha um papel não apoptótico no desenvolvimento das células germinativas masculinas através do controle do ciclo celular.
Nos seres humanos e mamíferos em geral, a linhagem germinativa origina-se a partir de uma população de células progenitoras, chamadas células germinativas primordiais (CGP), as quais segregam da linhagem somática, na região do epiblasto, durante as fases iniciais da embriogênese. Logo após a especificação, as CGP iniciam um processo de migração através do endoderma do intestino primitivo posterior e do seu mesentério dorsal, migrando bilateralmente para as cristas gonadais em desenvolvimento. Durante e após a migração, as CGP proliferam e aumentam rapidamente sua população. Após esse período, na gônada masculina, as células germinativas sofrem parada do ciclo celular, iniciando um período de quiescência, e passam a ser chamadas de gonócitos. Por se encontrarem em quiescência, os gonócitos são pouco estudados, de forma que os mecanismos de regulação e o estabelecimento da quiescência das células germinativas e a retomada do ciclo celular não são totalmente esclarecidos. Estudos realizados pelo nosso grupo demonstram que os gonócitos realizam mitoses consecutivas até o 18dpc (dia pós-coito), em ratos, sendo que aos 19dpc todos se encontram quiescentes. Durante este período, os gonócitos permanecem na fase G0/G1 do ciclo celular, não havendo alteração do seu número ou morte por apoptose. Estudos anteriores também realizados pelo nosso grupo identificaram, em gonócitos quiescentes de ratos, que a presença de expressão proteica de Caspase-3 (Casp3) parece ser independente da sua função apoptótica e apresenta um padrão de localização semelhante ao da proteína NANOG. Além disso, evidências em células-tronco embrionárias também sugerem que a ativação da Casp3 esteja associada à clivagem de fatores de pluripotência, como o Nanog. Objetivo: Desta forma, o objetivo deste estudo é investigar se existe interação entre Casp3 e NANOG e se a inibição da atividade de Casp3 pode levar a alterações na expressão de marcadores do ciclo celular dos gonócitos em quiescência. Métodos: Testículos embrionários de ratos foram coletados aos 19dpc, os gonócitos foram isolados e mantidos em cultura com inibidor da atividade de Casp3. A expressão de genes envolvidos com o controle do ciclo celular e pluripotência foi analisada através da técnica de PCR em tempo real. A análise da viabilidade dos gonócitos em cultura foi observada através da Citometria de Fluxo, sendo os gonócitos marcados com iodeto de propídio. A expressão proteica de NANOG e Casp3 também foi investigada em testículos de 19dpc. Resultados: A análise da viabilidade, surpreendentemente demonstrou aumento no número de células apoptóticas nas culturas tratadas com inibidor da atividade de Casp3, quando comparadas com as culturas controles. Referente à avaliação da presença de marcadores do ciclo celular dos gonócitos em cultura, foi possível observar que as culturas tratadas apresentaram diminuição na expressão dos marcadores Bcl2, Kras, p21cip e p27kip e aumento de Pcna. Além disso, as culturas foram comparadas à expressão de gonócitos que não passaram pelas 24 horas de cultura, em que se observou um aumento da expressão de p21cip e p27kip, em ambas as culturas e de p27kip nas culturas controles. Os marcadores de pluripotência, Sox2 e Nanog, não foram detectados in vitro, embora Sox2 tenha sido detectado nos gonócitos que não passaram pelas 24 horas de cultura. Conclusão: Os dados obtidos indicam que a inibição da proteína Casp3 afeta a expressão de marcadores clássicos do ciclo celular, sugerindo que a Casp3 desempenha um papel não apoptótico no desenvolvimento das células germinativas masculinas através do controle do ciclo celular.