Biologia vascular: síntese e remodelamento de moléculas da matriz extracelular e de superfície de células endoteliais em artéria carótida de camundongos ApoE-/-.
Data
2021
Autores
Russo, Thatiane Amaral 
Orientadores
Regatieri, Juliana Luporini Dreyfuss
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
The endothelium is composed of a monolayer of cells and their basemant membrane, which line the inside of the blood vessels and are responsible for maintaining vascular homeostasis. Under physiological conditions, it maintains vascular tone, laminar blood flow, coagulation process, cell proliferation and migration and control of the inflammatory response. Endothelial cells (ECs) respond to mechanical forces such as cell stretching and shear stress, influencing cellular behavior such as: morphology, migration, adhesion and angiogenesis, where many extracellular matrix (ECM) and cell surface components play a fundamental role. Endothelial dysfunction can cause cardiovascular diseases, such as hypertension, thrombosis and atherosclerosis, and these diseases can be modulated by the mechanical forces applied to the artery wall. This study aimed to investigate the remodeling of ECM and molecules associated with this remodeling in ECs submitted in vitro to two mechanical stimuli, cell stretching and shear stress, both in physiological and pathological conditions. After the stimuli, tests of cell behavior (adhesion, cell migration and formation of capillary structures), analysis of the biosynthesis of glycosaminoglycans by incorporating 35S, immunofluorescence, qPCR and qPCR array were performed. Both mechanical forces induced changes the ECs morphology, cell adhesion, migration and formation of capillary structures in culture were modulated positively in physiological conditions and negatively in pathological situations. The pathological mechanical forces applied to ECs induced a higher gene expression of syndecan-4, perlecan, versican, decorin, fibronectin, collagen III α1, connexin-43, VEGFA, TGF-β1 and TGF-β3. In addition, in vivo assays with ApoE-/- deficient mice were used as an animal model to study ECM remodeling in atherosclerotic disease. For this purpose the carotids of ApoE-/- mice were analyzed by high resolution ultrasound, demonstrating that there was an increase in the internal diameter and internal thickness (IMT) of these vessels, characterizing an artery dysfunction. Then these carotids were removed and subjected to analysis of gene expression by qPCR and qPCR array, immunofluorescence and histopathology. It was possible to observe a higher gene expression and a higher fluorescence intensity of syndecan-4, perlecan, versican and connexin-43 in carotids of ApoE-/- mice when compared to wild type control mice. The results of the qPCR array demonstrated higher expression of adhesion molecules, laminins and integrins and genes related to ECM proteolysis in carotids of ApoE-/- mice when compared to wild type control mice. This study helps to understand the remodeling and associated molecules of the ECM in in vitro and in vivo models of cardiovascular diseases, and how the endothelium can be affected by the mechanical forces of cell stretching and shear stress.
O endotélio é composto por uma monocamada de células e sua membrana basal, que revestem o interior dos vasos sanguíneos sendo responsável pela manutenção da homeostase vascular. Em condições fisiológicas, mantém o tônus vascular, o fluxo sanguíneo laminar, o equilíbrio da coagulação, a proliferação e migração celulares e o controle da resposta inflamatória. Células endoteliais (ECs) respondem às forças mecânicas tais como o estiramento celular e o shear stress influenciando o comportamento celular como: morfologia, migração, adesão e angiogênese, onde muitos componentes da matriz extracelular (MEC) e da superfície celular possuem papel fundamental. A disfunção endotelial pode gerar doenças cardiovasculares, como a hipertensão, trombose e aterosclerose, e estas doenças podem ser moduladas pelas forças mecânicas aplicadas à parede das artérias. Este estudo teve como objetivo investigar o remodelamento da MEC e moléculas associadas à este remodelamento em ECs submetidas in vitro a dois estímulos mecânicos, o estiramento celular e o shear stress, ambos em condições fisiológicas e patológicas. Após os estímulos, foram realizados ensaios de comportamento celular (adesão, migração celular e formação de estruturas do tipo capilar), análise da biosíntese de glicosaminoglicanos por incorporação de 35S, imunofluorescência, qPCR e qPCR array. Ambas as forças mecânicas induziram mudanças na morfologia das ECs. A adesão celular, migração e formação de estruturas do tipo capilar em cultura foram moduladas positivamente em condições fisiológicas e negativamente em situações patológicas. As forças mecânicas patológicas aplicadas às ECs induziram uma maior expressão gênica de sindecam-4, perlecam, versicam, decorim, fibronectina, colágeno III α1, conexina-43, VEGFA, TGF-β1 e TGF-β3. Além disso, ensaios in vivo com camundongos deficientes em ApoE-/- foram utilizados como modelo animal para estudo do remodelamento da MEC em doença aterosclerótica. Para este propósito as carótidas de camundongos ApoE-/- foram analisadas por ultrassonografia de alta resolução, demonstrando que houve um aumento do diâmetro interno e da espessura interna (IMT) destas artérias, caracterizando uma disfunção arterial. Em seguida estas carótidas foram removidas e submetidas a análises de expressão gênica por qPCR e qPCR array, imunofluorescência e histopatologia. Pôde-se observar uma maior expressão gênica e maior intensidade de fluorescência de sindecam-4, perlecam, versicam e conexina-43 em carótidas de camundongos ApoE-/- quando comparadas aos camundongos controle wild type. Os resultados de qPCR array demonstraram maior expressão de moléculas de adesão, lamininas e integrinas e genes relacionados à proteólise da MEC em carótidas de camundongos ApoE-/- quando comparadas aos camundongos controle wild type. Esse estudo auxilia no entendimento do remodelamento da MEC e moléculas associadas em modelos in vitro e in vivo de doenças cardiovasculares, e de como o endotélio pode ser afetado pelas forças mecânicas de estiramento celular e shear stress.
O endotélio é composto por uma monocamada de células e sua membrana basal, que revestem o interior dos vasos sanguíneos sendo responsável pela manutenção da homeostase vascular. Em condições fisiológicas, mantém o tônus vascular, o fluxo sanguíneo laminar, o equilíbrio da coagulação, a proliferação e migração celulares e o controle da resposta inflamatória. Células endoteliais (ECs) respondem às forças mecânicas tais como o estiramento celular e o shear stress influenciando o comportamento celular como: morfologia, migração, adesão e angiogênese, onde muitos componentes da matriz extracelular (MEC) e da superfície celular possuem papel fundamental. A disfunção endotelial pode gerar doenças cardiovasculares, como a hipertensão, trombose e aterosclerose, e estas doenças podem ser moduladas pelas forças mecânicas aplicadas à parede das artérias. Este estudo teve como objetivo investigar o remodelamento da MEC e moléculas associadas à este remodelamento em ECs submetidas in vitro a dois estímulos mecânicos, o estiramento celular e o shear stress, ambos em condições fisiológicas e patológicas. Após os estímulos, foram realizados ensaios de comportamento celular (adesão, migração celular e formação de estruturas do tipo capilar), análise da biosíntese de glicosaminoglicanos por incorporação de 35S, imunofluorescência, qPCR e qPCR array. Ambas as forças mecânicas induziram mudanças na morfologia das ECs. A adesão celular, migração e formação de estruturas do tipo capilar em cultura foram moduladas positivamente em condições fisiológicas e negativamente em situações patológicas. As forças mecânicas patológicas aplicadas às ECs induziram uma maior expressão gênica de sindecam-4, perlecam, versicam, decorim, fibronectina, colágeno III α1, conexina-43, VEGFA, TGF-β1 e TGF-β3. Além disso, ensaios in vivo com camundongos deficientes em ApoE-/- foram utilizados como modelo animal para estudo do remodelamento da MEC em doença aterosclerótica. Para este propósito as carótidas de camundongos ApoE-/- foram analisadas por ultrassonografia de alta resolução, demonstrando que houve um aumento do diâmetro interno e da espessura interna (IMT) destas artérias, caracterizando uma disfunção arterial. Em seguida estas carótidas foram removidas e submetidas a análises de expressão gênica por qPCR e qPCR array, imunofluorescência e histopatologia. Pôde-se observar uma maior expressão gênica e maior intensidade de fluorescência de sindecam-4, perlecam, versicam e conexina-43 em carótidas de camundongos ApoE-/- quando comparadas aos camundongos controle wild type. Os resultados de qPCR array demonstraram maior expressão de moléculas de adesão, lamininas e integrinas e genes relacionados à proteólise da MEC em carótidas de camundongos ApoE-/- quando comparadas aos camundongos controle wild type. Esse estudo auxilia no entendimento do remodelamento da MEC e moléculas associadas em modelos in vitro e in vivo de doenças cardiovasculares, e de como o endotélio pode ser afetado pelas forças mecânicas de estiramento celular e shear stress.