Avaliação do perfil imune em pacientes com linfoma de Hodgkin clássico com doença avançada
Data
2018-11-27
Autores
Icibaci, Priscilla Brito da Silva 
Orientadores
Baiocchi, Otavio Cesar Carvalho Guimaraes
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Classic Hodgkin's lymphoma is a curable disease in most cases; however,
approximately 25% of the patients present refractory or relapsed disease with a high
rate of lethality. The tumor microenvironment consists of only 1 to 5% of neoplastic
cells, named ReedSternberg
(RS) cells; the remaining be composed of normal
inflammatory cells. The reason for the lack of an effective immune response against
the tumor remains unknown. Immune imbalance reflects not only the tumor
microenvironment but also the particular anergic state of the patient with classical
Hodgkin's lymphoma (cHL). Therefore, a better understanding of this complex
network of cellular interactions involved in the immune response may contribute to
the development of new biomarkers and potential therapeutic targets. Purpose: In
this study, we aimed to evaluate immune gene expression profile by messenger
RNAs in peripheral blood of patients with cHL. Correlate the presence of EpsteinBarr
virus in RS cells with the expression of messenger RNAs in peripheral blood.
Correlate the messenger RNAs expression with clinical and laboratory characteristics.
To evaluate the impact of treatment on gene expression of messenger RNAs related
to the immune profile. Correlate the messenger RNAs expression in peripheral blood
of cHL patients with canonical pathways and gene networks. Validate immune gene
expression profile by measure soluble proteins serum levels of cHL patients.
Methods: We prospectively studied 27 cases of cHL diagnosed between October
2011 to October 2015 at the Universidade Federal de São Paulo and Hospital Santa
Marcelina. Additionally, 10 healthy controls were included and recruited from our
University Blood Bank. Peripheral blood samples of cHL patients were collected at
diagnosis and after treatment. The general expression of 96 messengers RNAs
present in the peripheral blood and involved in immune response was performed by a
customized quantitative realtime
PCR array (TaqMan®Low Density Array). The data
was normalized with B2M mRNAs levels and relative gene expression was
calculated by the 2^DDCt method, considering Wilcoxon test and BenjaminiHochberg
adjustment to correct pvalues.
Soluble proteins were measured by
enzymelinked
immunosorbent assay (ELISA). Results: Nineteen patients with cHL
were evaluated, median age at diagnosis was 29 years, and 63% were male. IL23A
expression were associated with the presence of EBV (p=0.040, p=0.054, p=0.040,
respectively). We observed an increase in expression of CD274 (PDL1)
(2 times p=
0.011), CD28 (1.5 times p=
0.049), CTLA4 (1.6 times p
= 0.005), FAS (1.5 times – p=0.025), ICOS (2.3 times – p=0.004), IL10
(3 times p=0.003) and CASP1 (1.5
times – p=0,042) in the samples at diagnosis when compared to the end of treatment.
Compared to healthy controls, we found higher expression of IL10
(2.5 times padj=
0.009) in the samples at diagnosis. Regarding the dosage of soluble proteins,
we observed that patients with B symptoms (p=0.048), bulky disease (p=0.023),
advanced staging (p=0.048), ESR and albumin altered (p=0.006, p=0.008
respectively) were associated with elevated levels of sPDL1,
that had impact in
overall survival of cHL patients. Increased levels of sCTLA4
were associated with
highrisk
IPS (p=0.013). Elevated levels of sPDL1
were observed at diagnosis when
compared to healthy controls (p=0.023). After treatment the levels of IL10
(p=0.001),
sPD1
(p = 0.006) and sPDL1
(p=0.002) were significantly reduced. Compared to
healthy controls IL10
levels remained high (p=0.0003). Conclusion: This study
demonstrates an increase in the expression of genes with antiinflammatory
and
immunosuppressive characteristics in patients with cHL at diagnosis. Our study also
showed that the presence of EBV was related to the expression of proinflammatory
cytokines (IL2,
IL7
and IL23A).
Additionally, treatment reduced sPD1,
sPDL1
and
IL10
serum levels, that were high at diagnosis. There was a correlation of sPDL1
with presence of B symptoms, advanced staging, presence of bulky disease,
increased ESR and decreased albumin, and association of sCTLA4
with highrisk
IPS. The treatment had a positive impact on gene expression and on immune
checkpoints serum levels with a modification for increased expression of genes that
may be related to immune reconstitution. Certainly, more studies investigating the
impact of the immune evasion mechanisms of the RS cells and the contribution of the
inflammatory microenvironment in the clinical evolution of the patient with cHL will
contribute to a better understanding of the characteristic anergy of these patients and
to the possible development of new biomarkers and therapeutic strategies.
Introdução: O linfoma de Hodgkin clássico é uma doença curável na maioria dos casos, porém aproximadamente 25% dos pacientes apresentam doença refratária ou recidivada com alto índice de letalidade. O microambiente tumoral é composto de apenas 1 a 5% de células neoplásicas, denominadas células de ReedSternberg (RS), sendo todo o restante composto por células inflamatórias normais. A razão da falta de uma resposta imune eficaz contra o tumor permanece desconhecida. Este desequilíbrio imunológico reflete não somente no microambiente tumoral mas também no estado anérgico característico do paciente com linfoma de Hodgkin clássico (LHc). Portanto, o melhor entendimento desta complexa rede de interações celulares envolvidas na resposta imune pode contribuir para o desenvolvimento de novos biomarcadores e potenciais alvos terapêuticos. Objetivos: Este projeto teve como objetivo avaliar a expressão gênica de RNAs mensageiros associados ao perfil imune no sangue periférico de pacientes com linfoma de Hodgkin clássico. Correlacionar a presença do vírus EpsteinBarr nas células de RS com a expressão de RNAs mensageiros no sangue periférico. Correlacionar a expressão de RNAs mensageiros com as características clínicas e laboratoriais. Avaliar o impacto do tratamento na expressão dos RNAs mensageiros relacionados ao perfil imune. Correlacionar a expressão de RNAs mensageiros no sangue periférico de pacientes com LHc com as vias canônicas e redes gênicas. Validar a expressão de RNAs mensageiros através da dosagem de proteínas solúveis no soro dos pacientes com LHc. Casuística e método: Foram recrutados para este estudo, prospectivamente, 27 pacientes entre Outubro de 2011 a Outubro de 2015, em dois serviços de Hematologia distintos de São Paulo: Universidade Federal de São Paulo e Hospital Santa Marcelina. Foram incluídos, também, 10 controles saudáveis recrutados no banco de sangue do Hemocentro da UNIFESP após serem aprovados para doação. Amostras de sangue periférico foram coletadas ao diagnóstico e 90 a 180 dias após o tratamento. A expressão gênica de 96 RNAs mensageiros envolvidos na resposta imune foi realizada por PCR quantitativo em tempo real customizado (TaqMan® Low Density Array). As proteínas solúveis foram dosadas pelo teste imunoenzimático (ELISA). Resultados: Dos 27 pacientes recrutados neste período, 19 pacientes com linfoma de Hodgkin clássico estadiamento avançado foram avaliados, a mediana de idade ao diagnóstico foi de 29 anos e 63% eram do sexo masculino. Com relação ao EBV, 26% dos pacientes eram LHc EBVrelacionados. Pacientes com maior expressão de IL2, IL7 e IL23A foram associados com a presença de EBV (p=0,040; p=0,054; p=0,040 respectivamente). Observamos aumento na expressão de CD274 (PDL1) (2 vezes p= 0,011), CD28 (1,5 vezes p= 0,049), CTLA4 (1,6 vezes – p=0,005), FAS (1,5 vezes – p=0,025), ICOS (2,3 vezes – p=0,004), IL10 (3 vezes – p=0,003) e CASP1 (1,5 vezes – p=0,042), nas amostras ao diagnóstico quando comparadas ao final do tratamento. Comparado aos controles saudáveis, verificamos maior expressão de IL10 (2,5 vezes paj= 0,009) nas amostras ao diagnóstico. Com relação a dosagem das proteínas solúveis, observamos que os pacientes com sintomas B (p=0,048), massa bulky (p=0,023), estadiamento avançado (p=0,048), VHS e albumina alterados (p=0,006; p=0,008 respectivamente) foram associados com níveis elevados de sPDL1, que teve impacto na sobrevida global dos pacientes com LHc (p=0,0001). Níveis aumentados de sCTLA4 foi relacionado com IPS de alto risco (p=0,013). Altos níveis de sPDL1 foram observados ao diagnóstico quando comparados aos controles saudáveis (p=0,023). Após o tratamento os níveis de IL10 (p=0,001), sPD1 (p=0,006) e sPDL1 (p=0,002) foram significantemente reduzidos. Contudo, comparando a dosagem de IL10 após o tratamento com os controles saudáveis os níveis persistiram elevados (p=0,0003). Conclusão: Este estudo demonstra que há um aumento na expressão de genes com características antiinflamatórias e imunossupressoras nos pacientes com LHc ao diagnóstico. Nosso estudo também mostrou que a presença de EBV estava relacionada com a expressão de citocinas proinflamatórias (IL2, IL7 e IL23A). Houve correlação do sPDL1 com a presença de sintomas B, estadiamento avançado, presença de massa torácica bulky, VHS aumentado e albumina diminuída, e associação de sCTLA4 com IPS de alto risco. O tratamento teve impacto positivo sobre a expressão de genes, com uma modificação para maior expressão de genes que podem estar relacionados com a reconstituição imune. Certamente, mais estudos investigando o impacto dos mecanismos de evasão imune das células de RS e a contribuição do microambiente inflamatório na evolução clínica do paciente com LHc contribuirá para um melhor entendimento da anergia característica destes pacientes e para o possível desenvolvimento de novos biomarcadores e estratégias terapêuticas.
Introdução: O linfoma de Hodgkin clássico é uma doença curável na maioria dos casos, porém aproximadamente 25% dos pacientes apresentam doença refratária ou recidivada com alto índice de letalidade. O microambiente tumoral é composto de apenas 1 a 5% de células neoplásicas, denominadas células de ReedSternberg (RS), sendo todo o restante composto por células inflamatórias normais. A razão da falta de uma resposta imune eficaz contra o tumor permanece desconhecida. Este desequilíbrio imunológico reflete não somente no microambiente tumoral mas também no estado anérgico característico do paciente com linfoma de Hodgkin clássico (LHc). Portanto, o melhor entendimento desta complexa rede de interações celulares envolvidas na resposta imune pode contribuir para o desenvolvimento de novos biomarcadores e potenciais alvos terapêuticos. Objetivos: Este projeto teve como objetivo avaliar a expressão gênica de RNAs mensageiros associados ao perfil imune no sangue periférico de pacientes com linfoma de Hodgkin clássico. Correlacionar a presença do vírus EpsteinBarr nas células de RS com a expressão de RNAs mensageiros no sangue periférico. Correlacionar a expressão de RNAs mensageiros com as características clínicas e laboratoriais. Avaliar o impacto do tratamento na expressão dos RNAs mensageiros relacionados ao perfil imune. Correlacionar a expressão de RNAs mensageiros no sangue periférico de pacientes com LHc com as vias canônicas e redes gênicas. Validar a expressão de RNAs mensageiros através da dosagem de proteínas solúveis no soro dos pacientes com LHc. Casuística e método: Foram recrutados para este estudo, prospectivamente, 27 pacientes entre Outubro de 2011 a Outubro de 2015, em dois serviços de Hematologia distintos de São Paulo: Universidade Federal de São Paulo e Hospital Santa Marcelina. Foram incluídos, também, 10 controles saudáveis recrutados no banco de sangue do Hemocentro da UNIFESP após serem aprovados para doação. Amostras de sangue periférico foram coletadas ao diagnóstico e 90 a 180 dias após o tratamento. A expressão gênica de 96 RNAs mensageiros envolvidos na resposta imune foi realizada por PCR quantitativo em tempo real customizado (TaqMan® Low Density Array). As proteínas solúveis foram dosadas pelo teste imunoenzimático (ELISA). Resultados: Dos 27 pacientes recrutados neste período, 19 pacientes com linfoma de Hodgkin clássico estadiamento avançado foram avaliados, a mediana de idade ao diagnóstico foi de 29 anos e 63% eram do sexo masculino. Com relação ao EBV, 26% dos pacientes eram LHc EBVrelacionados. Pacientes com maior expressão de IL2, IL7 e IL23A foram associados com a presença de EBV (p=0,040; p=0,054; p=0,040 respectivamente). Observamos aumento na expressão de CD274 (PDL1) (2 vezes p= 0,011), CD28 (1,5 vezes p= 0,049), CTLA4 (1,6 vezes – p=0,005), FAS (1,5 vezes – p=0,025), ICOS (2,3 vezes – p=0,004), IL10 (3 vezes – p=0,003) e CASP1 (1,5 vezes – p=0,042), nas amostras ao diagnóstico quando comparadas ao final do tratamento. Comparado aos controles saudáveis, verificamos maior expressão de IL10 (2,5 vezes paj= 0,009) nas amostras ao diagnóstico. Com relação a dosagem das proteínas solúveis, observamos que os pacientes com sintomas B (p=0,048), massa bulky (p=0,023), estadiamento avançado (p=0,048), VHS e albumina alterados (p=0,006; p=0,008 respectivamente) foram associados com níveis elevados de sPDL1, que teve impacto na sobrevida global dos pacientes com LHc (p=0,0001). Níveis aumentados de sCTLA4 foi relacionado com IPS de alto risco (p=0,013). Altos níveis de sPDL1 foram observados ao diagnóstico quando comparados aos controles saudáveis (p=0,023). Após o tratamento os níveis de IL10 (p=0,001), sPD1 (p=0,006) e sPDL1 (p=0,002) foram significantemente reduzidos. Contudo, comparando a dosagem de IL10 após o tratamento com os controles saudáveis os níveis persistiram elevados (p=0,0003). Conclusão: Este estudo demonstra que há um aumento na expressão de genes com características antiinflamatórias e imunossupressoras nos pacientes com LHc ao diagnóstico. Nosso estudo também mostrou que a presença de EBV estava relacionada com a expressão de citocinas proinflamatórias (IL2, IL7 e IL23A). Houve correlação do sPDL1 com a presença de sintomas B, estadiamento avançado, presença de massa torácica bulky, VHS aumentado e albumina diminuída, e associação de sCTLA4 com IPS de alto risco. O tratamento teve impacto positivo sobre a expressão de genes, com uma modificação para maior expressão de genes que podem estar relacionados com a reconstituição imune. Certamente, mais estudos investigando o impacto dos mecanismos de evasão imune das células de RS e a contribuição do microambiente inflamatório na evolução clínica do paciente com LHc contribuirá para um melhor entendimento da anergia característica destes pacientes e para o possível desenvolvimento de novos biomarcadores e estratégias terapêuticas.