Clonagem e caracterização da adesina envolvida no padrão ALL de Escherichia coli enteropatogênica atípica (EPEC atípica)
Data
2001
Autores
Dulguer, Michelle Vanzella 
Orientadores
Scaletsky, Isabel Cristina Affonso
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
A adesao da bacteria a mucosa do intestino delgado e uma etapa importante na inducao de diarreia por amostras de E. coli. Tres padroes de adesao tem sido descritos em amostras de E. coli causadoras de diarreia: adesao localizada (AL), adesao agregativa (AA) e adesao difusa (AD). Recentemente, foi descrita uma nova classe de E. coli causadora de diarreia, caracterizada como E. coli enteropatogenica atipica (EPEC atipica), para designar amostras de EPEC que nao hibridizam com a sonda EAF. Amostras de EPEC atipica apresentam um padrao de adesao denominado adesao localizada-like (ALL) em testes de cultura de celulas que empregam 6 horas de incubacao. O padrao ALL das amostras de EPEC atipica demonstra ser uma adesina geneticamente diferente da codificada pelo bfpA. Este trabalho teve como objetivo identificar os genes responsaveis pelo fenotipo da adesao ALL, apresentado pela amostra 22 pertencente ao sorotipo 026:H11 isolado de um caso de diarreia infantil na cidade de São Paulo. O DNA genomico dessa amostra foi extraido, parcialmente digerido com Sau 3A e clonado no vetor cosmidio pHC79. A biblioteca genomica foi transformada na E. coli Kl2 DH5a e os clones recombinantes foram testados quanto a adesao as celulas HeLa. Um clone denominado de V-B-6 apresentou o padrao ALL em celulas HeLa de maneira semelhante a amostra 026:Hll. Este clone cosmidio apresenta um inserto de aproximadamente 32 kb Atraves do estudo da integridade da regiao LEE, utilizando sondas geneticas (A, B, C e D), verificamos que o clone nao apresenta nenhuma homologia com as 4 sondas geneticas e sendo negativo tambem para o teste de FAS. Utilizando tecnica de PCR para determinarmos outros fatores de virulencia que poderiam estar envolvidos, observamos que o clone cosmidio nao contem os genes para b-intimina, receptor Tir e locus efal. O soro anti-ALL produzido em coelho, apresentou efeito inibitorio da adesao tanto da amostra selvagem quanto do clone cosmidio. A analise atraves de Western blotting revelou uma proteina de membrana externa de aproximadamente 60 kDa no clone cosmidio V-B-6. A partir desses resultados, isolamos o anticorpo monoespecifico contra a proteina de 60 kDa e testamos quanto a capacidade de inibicao da adesao a celula HeLa onde observamos inibicao da adesao. Com este trabalho pudemos demonstrar que o padrao ALL apresentado pela EPEC atipica amostra 22, nao e mediado pela intimina e que a proteina de 60 kDa e uma das principais candidatas a ser mediadora da adesao
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2001. 109 p. ilus.