Avaliação dos mecanismos intracelulares da diferenciação mielóide por receptores P2
Data
2019-06-27
Autores
Araujo Junior, Roberto Theodoro De 
Orientadores
Gamero, Edgar Julian Paredes
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Hematopoiesis is the process by which the organism forms all the bloodlines that occurs throughout the life of the individual. The capacity for self-renewal, quiescence and differentiation in multiple steps presented by hematopoietic stem cells (HTCs) are essential characteristics for the maintenance of homeostasis of hematopoietic tissue. In addition to cytokines, other signaling agents such as ATP, secreted by endothelial cells and osteoblasts, can modulate hematopoiesis by the activation of extracellular receptors. Several works have shown the capacity of ATP and analogues, in activating P2 receptors, and in modulating the activity of mature hematopoietic cells and in CTHs. Our group demonstrated that extracellular ATP promotes differentiation of HTCs through the increase of intracellular calcium promoted by P2 receptors. Although the modulation of hematopoiesis by ATP and analogs through the activation of P2 receptors has been observed, the receptor subtypes involved and the intracellular pathways that depend on these effects have not been fully elucidated. This work aims to elucidate the intracellular pathways related to the induction of myeloid differentiation promoted by P2 receptors. It was demonstrated in the present study that CTHs undergo differentiation through the activation of P2 receptors, ATP-treated HTCs increase Ki67 cell proliferation marker expression, thus indicating that these cells have lost the characteristic quiescence of HTCs. In addition, the Pi3K / AKT pathways were activated, and AKT was phosphorylated at both activation sites, thus demonstrating that both the PDK-1 enzyme and the mTOR protein complex are involved in signaling this process. CaMKII and PKC enzymes of the calcium dependent pathways were also activated, but without activation of CaMKIV. Among the pathways activated by P2Y receptors are those of PLCβ3 which, among other actions, is capable of inducing an increase in cytosolic calcium. Some transcription factors such as Stats 3 and 5 were also evaluated, both of which were activated by Janus kinase-independent pathways, as well as the best known Bcl-2 oncoprotein due to its participation in the apoptotic control process, but which has a role in the process of cell differentiation. Finally, the ERK was activated in a sustained manner for up to 24 hours, the process of activation of the ERK pathway is strongly linked to differentiation processes, and to corroborate this result a specific inhibitor for MEK was able to reverse the induced differentiation process by ATP. xviii These data together suggest that P2 receptors lead hematopoietic stem cells to differentiate themselves by signaling many pathways and that the role of MAPK ERK is of fundamental importance for this process.
A hematopoese é o processo pelo qual o organismo forma todas as linhagens sanguíneas que ocorre durante toda a vida do indivíduo. A capacidade de auto renovação, quiescência e diferenciação em múltiplos passos apresentado pelas células-tronco hematopoéticas (CTHs) são características essenciais para a manutenção da homeostase do tecido hematopoético. Além das citocinas, outros sinalizadores como o ATP, secretado por células endoteliais e osteoblastos, podem modular a hematopoese por ativação de receptores extracelulares. Diversos trabalhos têm mostrados a capacidade do ATP e análogos, em ativar receptores P2, e em modular a atividade de células hematopoéticas maduras e em CTHs. Nosso grupo demonstrou que o ATP extracelular promove a diferenciação das CTHs através do aumento de cálcio intracelular promovido por receptores P2. Embora tenha sido observada a modulação da hematopoese por ATP e análogos através da ativação de receptores P2, os subtipos de receptores envolvidos e os caminhos intracelulares que dependem destes efeitos não têm sido completamente elucidados. Este trabalho tem como objetivo elucidar os caminhos intracelulares relacionados a indução da diferenciação mielóide promovida por receptores P2. Demonstrou-se no presente estudo que as CTHs sofrem diferenciação através da ativação de receptores P2, as CTHs tratadas com ATP aumentam a expressão do marcador de proliferação celular Ki67, indicando assim, que estas células perderam a quiescência, característica das CTHs. Além disso as vias Pi3K/AKT foram ativadas, sendo que a AKT foi fosforilada em ambos sítios de ativação, demonstrando assim que tanto a enzima PDK-1 quanto o complexo proteico mTOR estão envolvidos na sinalização deste processo. As enzimas CaMKII e PKC das vias dependentes de cálcio também foram ativadas, porém sem ativação da CaMKIV. Entre as vias ativadas por receptores P2Y estão as da PLCβ3 que dentre outras ações, é capaz de induzir o aumento do cálcio citosólico. Avaliou-se também a alguns fatores de transcrição como as Stats 3 e 5, ambas foram ativadas por vias independentes de Janus quinases, bem como a oncoproteína Bcl-2 mais conhecida devido a sua participação no processo de controle apoptótico, mas que possui papel no processo de diferenciação celular. E por fim a ERK foi ativada de forma sustentada por até 24 horas, o processo de ativação da via ERK está fortemente ligado a processos de diferenciação, e para corroborar este resultado um inibidor xvi específico para a MEK foi capaz de reverter o processo de diferenciação induzido pelo ATP. Estes dados em conjunto nos sugerem que os receptores P2 levam as células tronco hematopoiéticas a se diferenciarem por meio da sinalização de muitas vias, e que o papel da MAPK ERK é de fundamental importância para este processo.
A hematopoese é o processo pelo qual o organismo forma todas as linhagens sanguíneas que ocorre durante toda a vida do indivíduo. A capacidade de auto renovação, quiescência e diferenciação em múltiplos passos apresentado pelas células-tronco hematopoéticas (CTHs) são características essenciais para a manutenção da homeostase do tecido hematopoético. Além das citocinas, outros sinalizadores como o ATP, secretado por células endoteliais e osteoblastos, podem modular a hematopoese por ativação de receptores extracelulares. Diversos trabalhos têm mostrados a capacidade do ATP e análogos, em ativar receptores P2, e em modular a atividade de células hematopoéticas maduras e em CTHs. Nosso grupo demonstrou que o ATP extracelular promove a diferenciação das CTHs através do aumento de cálcio intracelular promovido por receptores P2. Embora tenha sido observada a modulação da hematopoese por ATP e análogos através da ativação de receptores P2, os subtipos de receptores envolvidos e os caminhos intracelulares que dependem destes efeitos não têm sido completamente elucidados. Este trabalho tem como objetivo elucidar os caminhos intracelulares relacionados a indução da diferenciação mielóide promovida por receptores P2. Demonstrou-se no presente estudo que as CTHs sofrem diferenciação através da ativação de receptores P2, as CTHs tratadas com ATP aumentam a expressão do marcador de proliferação celular Ki67, indicando assim, que estas células perderam a quiescência, característica das CTHs. Além disso as vias Pi3K/AKT foram ativadas, sendo que a AKT foi fosforilada em ambos sítios de ativação, demonstrando assim que tanto a enzima PDK-1 quanto o complexo proteico mTOR estão envolvidos na sinalização deste processo. As enzimas CaMKII e PKC das vias dependentes de cálcio também foram ativadas, porém sem ativação da CaMKIV. Entre as vias ativadas por receptores P2Y estão as da PLCβ3 que dentre outras ações, é capaz de induzir o aumento do cálcio citosólico. Avaliou-se também a alguns fatores de transcrição como as Stats 3 e 5, ambas foram ativadas por vias independentes de Janus quinases, bem como a oncoproteína Bcl-2 mais conhecida devido a sua participação no processo de controle apoptótico, mas que possui papel no processo de diferenciação celular. E por fim a ERK foi ativada de forma sustentada por até 24 horas, o processo de ativação da via ERK está fortemente ligado a processos de diferenciação, e para corroborar este resultado um inibidor xvi específico para a MEK foi capaz de reverter o processo de diferenciação induzido pelo ATP. Estes dados em conjunto nos sugerem que os receptores P2 levam as células tronco hematopoiéticas a se diferenciarem por meio da sinalização de muitas vias, e que o papel da MAPK ERK é de fundamental importância para este processo.