Efeitos e mecanismos da privação alimentar sobre o metabolismo mitocondrial de Caenorhabditis elegans
Data
2022-02-22
Autores
Santos, Felipe Macedo 
Orientadores
Cunha, Fernanda Marques da
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: Dietary deprivation was one of the most frequent evolutionary
pressures. Because of that, living organisms developed complex mechanisms to
survive those challenges. Mitochondria are dynamic organelles that respond to
cellular signals and rewire their metabolism in order to maintain the cellular energy
homeostasis. In Caenorhabditis elegans, as well as in other organisms, part of the
response to dietary deprivation depends on the modulation of mitochondrial activity
and signaling proteins such as AMP-activated protein kinase (AMPK), a sensor that
coordinates the cellular response to energy unbalance. In this scenario, AMPK
activation stimulates catabolic pathways and inhibits anabolic pathways,
reestablishing the energetic balance. Objective: To evaluate the effects of bacterial
deprivation, and the possible involvement of the AMPK kinase, on C. elegans
mitochondria. Methods: N2 Bristol worms were used as wild-type strain. aak-2
(ok524) and AAK-2 CA (WBM60) strains were used as AMPK loss- and gain-of-function mutants, respectively. Early egg-laying adults from all groups were
submitted to ad libitum or bacterial deprivation diets for 24 hours, and then harvested
for assays. Respiratory rates were evaluated in vivo and in isolated mitochondria by
high resolution respirometry. Mitochondrial mass was determined by citrate synthase
activity in animal extracts. Mitochondrial membrane potential was determined by
measuring differences in Safranine O fluorescence. Proton flux through inner
membrane was indirectly evaluated by measuring oxygen consumption rates in
different membrane potential values. Proteomics were conducted by digestion of
proteins followed by separation and identification of peptides by liquid
chromatography coupled to mass spectrometer. Results: Bacterial deprivation
reduced the in vivo respiration of wild-type animals, an effect due, at least in part, to
reduced mitochondrial mass. The same phenotype was observed on AMPK loss- or
gain-of-function mutants, suggesting that bacterial deprivation-induced decrease in in
vivo respiration is AMPK-independent. Bacterial deprivation increased complex I- and
β-oxidation-supported respiration in mitochondria isolated from wild-type animals.
However, this effect was not observed in mitochondria isolated from AMPK loss- or
gain-of-function mutants, suggesting that a transitory activation of AMPK during
dietary deprivation is necessary for mitochondrial metabolism rewiring. Membrane
potential was not affected by bacterial deprivation or AMPK mutations. Twenty-five of
the identified proteins in our proteomics analysis were differentially expressed in
mitochondria from wild-type animals subjected to bacterial deprivation, with some of
them being dependent on AMPK signaling to be remodeled. Conclusion: We have
shown that bacterial deprivation impacts mitochondrial energy metabolism in C.
elegans, and some alterations are AMPK-dependent. The bacterial deprivation-induced changes in mitochondrial activity are accompanied by remodeling of the
mitochondrial proteome, which explains, at least in part, the increased respiratory
capacity observed in mitochondria isolated from bacteria deprived wild-type worms.
Our data suggest that oxidation of respiratory substrates at the electron transport
chain is responsible for the bacterial deprivation-induced increased respiratory
capacity. However, we do not exclude the participation of other parameters, such as
alterations in mitochondrial morphology or cristae density, in the regulation of this
process. In the future, it will be interesting to check whether those parameters are
part of mitochondrial adaptation to bacterial deprivation as well as to unravel the
effectors downstream AMPK that lead to mitochondrial phenotype remodeling.
Introdução: A privação alimentar foi um dos desafios ambientais mais frequentes durante a evolução, e por isso os organismos vivos desenvolveram mecanismos complexos para sobreviver a esse desafio. Mitocôndrias são organelas dinâmicas que respondem a sinais celulares e remodelam seu metabolismo a fim de manter a homeostase energética celular. Em Caenorhabditis elegans, bem como em outros organismos, parte da resposta à privação alimentar depende da modulação da atividade mitocondrial e de proteínas sinalizadoras como a quinase ativada por AMP (AMPK), um sensor que coordena a resposta celular ao desequilíbrio energético. A ativação da AMPK nessas situações resulta em estímulo de vias catabólicas e inibição de vias anabólicas, restaurando o balanço energético. Objetivo: Avaliar os efeitos da privação alimentar, e o possível envolvimento da quinase AMPK, sobre o metabolismo mitocondrial de C. elegans. Métodos: Animais N2 Bristol foram usados como linhagem selvagem. As linhagens aak-2 (ok524) e AAK-2 CA (WBM60) foram usadas como mutantes perda- e ganho-de-função para AMPK, respectivamente. Todos os grupos foram submetidos à dieta ad libitum ou de privação alimentar por 24 horas a partir do início da fase adulta. A taxa respiratória foi avaliada por respirometria de alta resolução in vivo e em mitocôndrias isoladas. A massa mitocondrial foi determinada pela avaliação da atividade da citrato sintase em extratos de animais. O potencial de membrana mitocondrial foi determinado por variação da fluorescência da safranina O. O fluxo de prótons através da membrana interna foi avaliado indiretamente por determinação do consumo de oxigênio em função do potencial de membrana mitocondrial. A proteômica de mitocôndrias foi realizada por digestão das proteínas, separação e identificação dos peptídeos por cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas. Resultados: A privação alimentar diminui o consumo de oxigênio in vivo de animais selvagens, um efeito causado, em parte, por diminuição da massa mitocondrial. A mesma diminuição da respiração in vivo é observada em mutantes com perda ou ganho de função para AMPK, sugerindo que a quinase não regula este processo. A privação alimentar aumenta a capacidade respiratória dependente de complexo I e β-oxidação em mitocôndrias de animais selvagens. Entretanto, este efeito não foi observado em mitocôndrias isoladas de mutantes com perda ou ganho de função para AMPK, sugerindo que a ativação transitória de AMPK em resposta à privação alimentar é fundamental para o remodelamento do metabolismo mitocondrial induzido pela dieta. O potencial de membrana não é afetado pela privação alimentar ou em mutantes AMPK. Do total de proteínas detectadas na proteômica, 25% encontram-se diferentemente expressas em mitocôndrias de animais privados de alimentação, sendo que a regulação da expressão de uma parcela dessas proteínas depende da ativação de AMPK durante a BD. Conclusão: Mostramos que a BD impacta o metabolismo energético mitocondrial de C. elegans, sendo parte das alterações dependentes da atividade da AMPK. As alterações bioenergéticas promovidas pela BD são acompanhadas de alteração na expressão de diversas proteínas, o que explica, em parte, o aumento da capacidade respiratória induzida pela dieta. Nossos dados sugerem que o aumento da capacidade respiratória observada em mitocôndrias de animais selvagens submetidos à privação alimentar é decorrente de uma maior capacidade de oxidação dos substratos pela cadeia de transporte de elétrons. Entretanto, não excluímos a possibilidade de outros processos não investigados neste trabalho, como alterações na morfologia ou densidade de cristas mitocondriais, participarem na regulação deste processo. As vias reguladas pela AMPK são alvos interessantes para uma averiguação futura dos efetores responsáveis pela alteração do metabolismo mitocondrial.
Introdução: A privação alimentar foi um dos desafios ambientais mais frequentes durante a evolução, e por isso os organismos vivos desenvolveram mecanismos complexos para sobreviver a esse desafio. Mitocôndrias são organelas dinâmicas que respondem a sinais celulares e remodelam seu metabolismo a fim de manter a homeostase energética celular. Em Caenorhabditis elegans, bem como em outros organismos, parte da resposta à privação alimentar depende da modulação da atividade mitocondrial e de proteínas sinalizadoras como a quinase ativada por AMP (AMPK), um sensor que coordena a resposta celular ao desequilíbrio energético. A ativação da AMPK nessas situações resulta em estímulo de vias catabólicas e inibição de vias anabólicas, restaurando o balanço energético. Objetivo: Avaliar os efeitos da privação alimentar, e o possível envolvimento da quinase AMPK, sobre o metabolismo mitocondrial de C. elegans. Métodos: Animais N2 Bristol foram usados como linhagem selvagem. As linhagens aak-2 (ok524) e AAK-2 CA (WBM60) foram usadas como mutantes perda- e ganho-de-função para AMPK, respectivamente. Todos os grupos foram submetidos à dieta ad libitum ou de privação alimentar por 24 horas a partir do início da fase adulta. A taxa respiratória foi avaliada por respirometria de alta resolução in vivo e em mitocôndrias isoladas. A massa mitocondrial foi determinada pela avaliação da atividade da citrato sintase em extratos de animais. O potencial de membrana mitocondrial foi determinado por variação da fluorescência da safranina O. O fluxo de prótons através da membrana interna foi avaliado indiretamente por determinação do consumo de oxigênio em função do potencial de membrana mitocondrial. A proteômica de mitocôndrias foi realizada por digestão das proteínas, separação e identificação dos peptídeos por cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas. Resultados: A privação alimentar diminui o consumo de oxigênio in vivo de animais selvagens, um efeito causado, em parte, por diminuição da massa mitocondrial. A mesma diminuição da respiração in vivo é observada em mutantes com perda ou ganho de função para AMPK, sugerindo que a quinase não regula este processo. A privação alimentar aumenta a capacidade respiratória dependente de complexo I e β-oxidação em mitocôndrias de animais selvagens. Entretanto, este efeito não foi observado em mitocôndrias isoladas de mutantes com perda ou ganho de função para AMPK, sugerindo que a ativação transitória de AMPK em resposta à privação alimentar é fundamental para o remodelamento do metabolismo mitocondrial induzido pela dieta. O potencial de membrana não é afetado pela privação alimentar ou em mutantes AMPK. Do total de proteínas detectadas na proteômica, 25% encontram-se diferentemente expressas em mitocôndrias de animais privados de alimentação, sendo que a regulação da expressão de uma parcela dessas proteínas depende da ativação de AMPK durante a BD. Conclusão: Mostramos que a BD impacta o metabolismo energético mitocondrial de C. elegans, sendo parte das alterações dependentes da atividade da AMPK. As alterações bioenergéticas promovidas pela BD são acompanhadas de alteração na expressão de diversas proteínas, o que explica, em parte, o aumento da capacidade respiratória induzida pela dieta. Nossos dados sugerem que o aumento da capacidade respiratória observada em mitocôndrias de animais selvagens submetidos à privação alimentar é decorrente de uma maior capacidade de oxidação dos substratos pela cadeia de transporte de elétrons. Entretanto, não excluímos a possibilidade de outros processos não investigados neste trabalho, como alterações na morfologia ou densidade de cristas mitocondriais, participarem na regulação deste processo. As vias reguladas pela AMPK são alvos interessantes para uma averiguação futura dos efetores responsáveis pela alteração do metabolismo mitocondrial.
Descrição
Citação
Santos, Felipe Macedo. Efeitos e mecanismos da privação alimentar sobre o metabolismo mitocondrial de Caenorhabditis elegans. São Paulo, 2022. 96 f. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) – Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2022.