PCR em embriões bovinos: proposição de modelos de treinamento
Data
2002
Autores
Almodin, Carlos Gilberto 
Orientadores
Moron, Antonio Fernandes
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Objetivo: Desenvolver um protocolo animal de treinamento para equipe interessada em adquirir conhecimentos e destreza tecnica no manuseio de embrioes com finalidade de realizar diagnostico pre-implantacao atraves da tecnica de reacao em cadeia da polimerase (PCR). Metodos: Realizamos procedimentos, com retirada dos ovarios de vacas em abatedouro, sem qualquer criterio de escolha das mesmas. Os ovarios apos serem assepticamente retirados foram levados em cuba esteril para laboratorio de fertilizacao. Os foliculos com diametro inferior a 8 mm foram puncionados com seringa descartavel de 10 ml e agulha 21 G. Os ovocitos retirados do liquido folicular sob microscopio estereoscopio foram lavados em solucao salina tamponada (D-PBS) e transferidos para placas Nunc contendo meio de cultura para maturacao. Os ovocitos obtidos, separados para o estudo apos 24 horas de maturacao, foram fertilizados com aproximadamente 1.000.000/ml de espermatozoides e mantidos em cultivo em meio de fertilizacao. Apos fertilizados, foram transferidos para placas de co-cultura com celulas vero, e mantidos em incubadora com 5 por cento de C02, 20 por cento de oxigenio e 75 por cento de nitrogenio a 37º C e umidade de 90 por cento, por cinco dias. Apos este periodo, separamos os embrioes com 8 ou mais blastomeros, aleatoriamente, em dois grupos. Um deles foi mantido em cultivo com o mesmo meio e mesmas condicoes para servir como grupo controle, o outro foi submetido a biopsia. Apos abertura da zona pelucida, retiramos 1 ou 2 blastomeros dos embrioes, com a utilizacao de microscopio invertido e equipamento de micromanipulacao. Em seguida a biopsia, os embrioes permaneceram em co-cultura por mais tres dias. Ao final deste tempo, avaliamos o desenvolvimento comparativamente com o grupo controle. Foi realizado estudo morfologico dos embrioes ate o estagio de blastocisto ou extrusao da zona pelucida (hatching), identificando o fenomeno de cavitacao e estreitamento da zona pelucida, e contagem do numero de celulas atraves de coloracao especifica para nucleos com o intuito de comprovar a inocuidade da biopsia. Cinquenta embrioes e seus blastomeros biopsiados foram submetidos a reacao em cadeia da polimerase para identificacao do sexo. Resultados: Dos 57 embrioes biopsiados, 40 atingiram o estagio de blastocisto, (70,2 por cento) e em 11 foi observado o hatching (27,5 por cento). Nos embrioes co-cultivados para controle foram obtidos...(au)
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2002. 94 p. ilustabgraf.