Avaliação da expressão do gene twist1 no microambiente hipóxico da leucemia mieloide aguda
Data
2015-11-25
Autores
Malafaia, Emilia Carolina Oliveira Brandao 
Orientadores
Kerbauy, Daniella Marcia Bahia
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
TWIST1, a basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor, plays a critical role in mesodermal development and organogenesis. Overexpressed TWIST1 has been thoroughly related to epithelial-mesenchymal transition (EMT) in solid tumors and has been described as an emerging poor prognostic factor in hematological neoplasms. Many questions remain to be addressed concerning to the role of TWIST1 in acute myeloid leukemia (AML). The understanding of TWIST1 in leukemia cells and its interaction with microenvironment can offer new insights in regards to physiopathology and therapeutic targets for patients with AML. Objectives: to evaluate the role of stroma contact and hypoxia in TWIST1 expression in myeloid cell lines. 2) To evaluate the functional impact of overexpressing TWIST1 on KG1a and PL21 cells. 3) To evaluate TWIST1 expression in primary cells of AML patients. Methods: In order to mimic bone marrow microenvironment, myeloid cells were co-cultured with mesenchymal HS5 cell line and PO2 1% was established with Smart -Trak ? 2 (Sierra Instruments, Inc.) equipment. Quantitative mRNA was determined using TaqMan ? Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) and 3-step standard cycling conditions with sequence-specific primer TWIST1 normalized to the expression of ?-actin. KG1a and PL21 cells were transduced with lentivirus vector carrying e-GFP ("enhanced green fluorescence protein") for stable expression of TWIST1. Transduced cells were sorted by FITC fluorochrome and then verified through western blot analysis with TWIST1 antibody. For quantification of apoptosis, cells were labeled with PE-conjugated antibody using annexin V?phycoerythrin and propidium iodide (BD Biosciences, USA). DAPI (4',6- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) was used to stain DNA and determine cell cycle information. Apoptosis and cell cycle were analyzed by FACS -Becton Dickinson Canto II (BD Biosciences). Statistical analysis was assessed with unpaired t test and Fisher?s exact test. Results: Hypoxia induced TWIST1 mRNA expression in OCIAML3, PL21, KG1a and ML1 cell lines (fold-increased 46.3, 29.8, 12.9 and 2.3 respectively). Cells expressing endogenous TWIST1 protein (OCIAML3 and ML1)! 88!showed resistance to apoptosis in a hypoxic microenvironment (normoxia versus hypoxia: OCI/AML3, 22.6 % vs 11.7% and ML1, 29.8% vs. 7.5%) in contrast, cells not expressing endogenous TWIST1 protein (KG1a and PL21) went to apoptosis in the same conditions. Thus, overexpressing TWIST1 in KG1a and PL21 induced apoptosis protection in hypoxia (KG1a unmodified vs. modified: 17.6 ± 6.3 vs. 2.8 ± 6.3, p=0.04; PL21 unmodified vs. modified: 26.9 ± 10.9 vs. 3.2 ± 0.6, p=0.04). We found increased TWIST1 mRNA levels in bone marrow samples of 18 AML patients (3,329 ± 0,64) compared with 6 healthy controls (1,25 ± 0,62) (p= 0.03). Patients in the highest tertile of TWIST1 expression did not show differences in prognostic and complete remission after treatment compared with patients in low and middle tertile. Conclusion: Our data suggest TWIST1 gene expression protects acute myeloid leukemia cells from apoptosis in a hypoxic microenvironment. Moreover, our results showed increased expression of TWIST1 in AML patients. Thus, TWIST1 is a potential gene involved in leukemogenesis and should be further explored to understand disease biology and potential therapeutic targets.
O gene TWIST1 é essencial para o desenvolvimento de embriões e migração de células mesodermiais. A superexpressão desse gene está relacionada ao processo de metástases que envolve a migração de células cancerígenas,transição epitélio mesenquimal em tumores sólidos e associado a um prognóstico ruim em neoplasias malignas hematopoiéticas. O papel do TWIST1 e suas interações com o microambiente é pouco conhecido na leucemia mieloide aguda (LMA) e avanços neste campo poderão contribuir para o entendimento da fisiopatologia da doença e novos potenciais alvos de tratamento. Objetivos: 1- comparar linhagens de células de LMA com e sem expressão endógena de TWIST1 em condições que simulam microambiente de medula óssea (hipóxia e suporte estromal). 2- Avaliar o impacto funcional da superexpressão do gene TWIST1 nas linhagens de leucemia mieloide aguda KG1a e PL21. 3- Avaliar a expressão do gene TWIST1 em células primárias de medula óssea de pacientes com LMA. Material e métodos: As linhagens de células mieloides foram avaliadas quanto a presença endógena de proteína TWIST1 através de Western blot. As linhagens KG1a e PL21 foram transduzidas com vetor lentiviral contendo o gene TWIST1 e gene repórter e-GFP (?enhanced green fluorescence protein?). As células transduzidas foram selecionadas através da técnica de citometria de fluxo (cell sorting pela detecção da proteína GFP através do fluorocromo FITC) e eficiência das transduções foi comprovada em Western blot. Para simular as condições do nicho de medula óssea, foram utilizadas linhagem de célula de estroma HS5 e estufa com concentração de O2 1% utilizando-se o equipamento Smart -Trak® 2 (Sierra Instruments, Inc.) As linhagens e células primarias foram avaliadas quanto a expressão relativa de RNA mensageiro através de técnica de RT-PCR em tempo real. A apoptose foi mensurada através da técnica de anexina-V conjugada a PE e Iodeto de Propidio (PI), e análise de ciclo celular através de técnica de coloração com DAPI (4?,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride). Resultados: 1-As linhagens de células mieloides KG1a, PL21, ML1 e OCI/AML3 apresentaram aumento de expressão do RNAm quando incubadas em condições de hipóxia (aumento relativo de 46,3; 29,8; 12.9 e 2.3, respectivamente). 2-As linhagens ML1 e OCI/AML3, as quais têm expressão endógena de proteína TWIST1,demonstraram resistência a apoptose induzida por hipóxia em condições que simularam microambiente da medula óssea (suspensão versus co-cultura: OCI/AML3, 22.6 % vs. 11,7% e ML1; 29,8% vs. 7,5%). 3- As linhagens PL21 e KG1a transduzidas com TWIST1 apresentaram menor apoptose espontânea em relação as linhagens não modificadas quando incubadas em hipoxia (KG1a vs. KG1a TWIST1: 17.6 ± 6.3 vs. 2.8 ± 6.3, p=0.04; PL21 vs.PL21 TWIST1: 26.9 ± 10.9 vs. 3.2 ± 0.6, p=0.04). 3- Constatamos aumento da expressão de TWIST1 na medula óssea de 18 pacientes (69%) com LMA !(n=26). A quantificação relativa (RQ) do RNAm de TWIST1 em 26 pacientes com LMA foi significantemente maior (3,32 ± 0,64) quando comparado a seis controles saudáveis (1,25 ± 0,62) (média ± SEM; p=0,03) Conclusões: Constatamos a importância do microambiente para a ativação do fenótipo de TWIST1 em células leucêmicas in vitro. Nosso trabalho traz novas informações sobre o efeito antiapotótico do TWIST1 em células mieloides e a expressão aumentada de TWIST1 em células primárias de medula óssea de pacientes com LMA. Além disso, hipóxia e estroma podem estar envolvidos na regulação da expressão do TWIST1 e regulação de apoptose. O entendimento do TWIST1 em LMA deve ser explorado no entendimento da biologia da doença e como potencial alvo terapêutico.!
O gene TWIST1 é essencial para o desenvolvimento de embriões e migração de células mesodermiais. A superexpressão desse gene está relacionada ao processo de metástases que envolve a migração de células cancerígenas,transição epitélio mesenquimal em tumores sólidos e associado a um prognóstico ruim em neoplasias malignas hematopoiéticas. O papel do TWIST1 e suas interações com o microambiente é pouco conhecido na leucemia mieloide aguda (LMA) e avanços neste campo poderão contribuir para o entendimento da fisiopatologia da doença e novos potenciais alvos de tratamento. Objetivos: 1- comparar linhagens de células de LMA com e sem expressão endógena de TWIST1 em condições que simulam microambiente de medula óssea (hipóxia e suporte estromal). 2- Avaliar o impacto funcional da superexpressão do gene TWIST1 nas linhagens de leucemia mieloide aguda KG1a e PL21. 3- Avaliar a expressão do gene TWIST1 em células primárias de medula óssea de pacientes com LMA. Material e métodos: As linhagens de células mieloides foram avaliadas quanto a presença endógena de proteína TWIST1 através de Western blot. As linhagens KG1a e PL21 foram transduzidas com vetor lentiviral contendo o gene TWIST1 e gene repórter e-GFP (?enhanced green fluorescence protein?). As células transduzidas foram selecionadas através da técnica de citometria de fluxo (cell sorting pela detecção da proteína GFP através do fluorocromo FITC) e eficiência das transduções foi comprovada em Western blot. Para simular as condições do nicho de medula óssea, foram utilizadas linhagem de célula de estroma HS5 e estufa com concentração de O2 1% utilizando-se o equipamento Smart -Trak® 2 (Sierra Instruments, Inc.) As linhagens e células primarias foram avaliadas quanto a expressão relativa de RNA mensageiro através de técnica de RT-PCR em tempo real. A apoptose foi mensurada através da técnica de anexina-V conjugada a PE e Iodeto de Propidio (PI), e análise de ciclo celular através de técnica de coloração com DAPI (4?,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride). Resultados: 1-As linhagens de células mieloides KG1a, PL21, ML1 e OCI/AML3 apresentaram aumento de expressão do RNAm quando incubadas em condições de hipóxia (aumento relativo de 46,3; 29,8; 12.9 e 2.3, respectivamente). 2-As linhagens ML1 e OCI/AML3, as quais têm expressão endógena de proteína TWIST1,demonstraram resistência a apoptose induzida por hipóxia em condições que simularam microambiente da medula óssea (suspensão versus co-cultura: OCI/AML3, 22.6 % vs. 11,7% e ML1; 29,8% vs. 7,5%). 3- As linhagens PL21 e KG1a transduzidas com TWIST1 apresentaram menor apoptose espontânea em relação as linhagens não modificadas quando incubadas em hipoxia (KG1a vs. KG1a TWIST1: 17.6 ± 6.3 vs. 2.8 ± 6.3, p=0.04; PL21 vs.PL21 TWIST1: 26.9 ± 10.9 vs. 3.2 ± 0.6, p=0.04). 3- Constatamos aumento da expressão de TWIST1 na medula óssea de 18 pacientes (69%) com LMA !(n=26). A quantificação relativa (RQ) do RNAm de TWIST1 em 26 pacientes com LMA foi significantemente maior (3,32 ± 0,64) quando comparado a seis controles saudáveis (1,25 ± 0,62) (média ± SEM; p=0,03) Conclusões: Constatamos a importância do microambiente para a ativação do fenótipo de TWIST1 em células leucêmicas in vitro. Nosso trabalho traz novas informações sobre o efeito antiapotótico do TWIST1 em células mieloides e a expressão aumentada de TWIST1 em células primárias de medula óssea de pacientes com LMA. Além disso, hipóxia e estroma podem estar envolvidos na regulação da expressão do TWIST1 e regulação de apoptose. O entendimento do TWIST1 em LMA deve ser explorado no entendimento da biologia da doença e como potencial alvo terapêutico.!
Descrição
Citação
MALAFAIA, Emilia Carolina Oliveira Brandao. Avaliação da expressão do gene twist1 no microambiente hipóxico da leucemia mieloide aguda. 2015. 87 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.