Navegando por Palavras-chave "Caenorhabditis elegans"
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- ItemAcesso aberto (Open Access)Autofagia mediada pelo canabidiol em modelo de Doença de Parkinson em Caenorhabditis elegans(Universidade Federal de São Paulo, 2024-06-28) Kano, Rodrigo Issamu [UNIFESP]; Pereira, Gustavo José da Silva [UNIFESP]; Trindade, Claudia Bincoletto [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/616900663495182; http://lattes.cnpq.br/7125107888186769; https://lattes.cnpq.br/8098981250558712O envelhecimento é o fator de risco primário para doenças neurodegenerativas como a Doença de Parkinson (DP). Muitos indivíduos acometidos pela DP recebem tratamento farmacológico paliativo que ajudam a controlar as manifestações clínicas da doença, porém, sem inibir sua progressão. Neste contexto, embora o canabidiol (CBD) tenha sido cada vez mais estudado na DP, devido a seus efeitos no sistema nervoso central e por apresentar efeitos neuroprotetores, o seu mecanismo de ação ainda não está totalmente elucidado. Muitas evidências apontaram para um papel do CDB na indução da autofagia em vários modelos celulares e animais. Sabe-se que a deficiência da autofagia leva ao acúmulo citosólico de agregados proteicos ubiquitinados, que são características importantes de processos neurodegenerativos, como os corpos de Lewis na DP, que são formados principalmente pela proteína α-sinucleína. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estudar a ação do CBD em modelos in vivo da Doença de Parkinson, avaliando a modulação da termotolerância, o papel da autofagia e uma possível via de ação HLH-30/TFEB. Foram utilizados modelos de C. elegans transgênicos, para expressão de GFP::LGG-1 e GFP::HLH-30, para a avaliação das proteínas LC3 e TFEB, respectivamente. A microscopia de fluorescência foi utilizada para avaliar os efeitos do CBD na formação de pontuações e a translocação de HLH-30/TFEB para o núcleo para avaliar uma possível indução da autofagia através da ativação do HLH-30/TFEB após o tratamento de CBD. Verificou-se também a possível modulação do CBD na longevidade pelo ensaio de termotolerância em diferentes concentrações, CBD 0,1 µM, CBD 0,5 µM, CBD 1 µM, CBD 5 µM e CBD 100 µM. Os dados obtidos por microscopia de fluorescência sugeriram a ativação do fluxo autofágico pela via TFEB após o tratamento com CBD a 100 μM por 2 horas. Dessa forma, esse estudo contribui para uma melhor compreensão sobre os potenciais alvos terapêuticos canabinoides e como perspectiva futura um possível papel neuroprotetor.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Avaliação dos mecanismos de virulência e do fitness bacteriano de isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae produtores de KPC-2(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-07-26) Visconde, Marina Francisco [UNIFESP]; Gales, Ana Cristina [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8402272715765172; http://lattes.cnpq.br/5369711625712661; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Objective: The aim of this study was to evaluate and compare the virulence and bacterial fitness of KPC-2-producing-K. pneumoniae isolates. Methods: A total of 30 K. pneumoniae clinical isolates distributed in three distinct groups, KPC-2-producing, ES?L-producing and community-acquired, were evaluated in this study. The genetic similarity among the isolates was determined by PFGE and MLST techniques. The antimicrobial susceptibility profile was determined by agar dilution and broth microdilution methodologies. The research of resistance and virulence genes were performed by PCR followed by DNA sequencing. OMPs characterization was evaluated by PCR, sequencing and SDS-PAGE techniques. For the in vitro evaluation of virulence factors, phenotypic tests were performed, such as the presence of hypermucoviscosity, biofilm formation, heat resistance, resistance to human serum, hemolysin production and phagocytosis by macrophages. The infection models using C. elegans and G. mellonella were performed for the evaluation of the in vivo virulence factors. The bacterial fitness was evaluated by measuring the growth rate of the isolates. Results: The genetic relationships evaluation showed the presence of 26 distinct PFGE patterns (A-Z) and 24 different STs distributed among 30 clinical isolates. High resistance rates to the antimicrobials agents tested were observed among KPC and ES?L groups. The resistance genes blaKPC, blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, and blaOKP were found in KPC and ES?L groups, while only the blaSHV and blaLEN genes were found in the community group. All isolates showed alterations in OmpK36. The PCR revealed the presence of virulence genes clpK, rmpA, mrkD, fimH, kpn, ycfm, kfu, Aero1, Aero2, iutA, entB, ybtS, fyuA and traT in all groups of this study. The hypermucoviscosity phenotype was found in only three isolates. All isolates were resistant to the factors present in human serum and able to form biofilms. All clpk carrying isolates survived the thermal shock, excepted isolated A23177. None of the isolates was able to produce hemolysin. Significant susceptibility differences in phagocytosis were observed in the KPC-2 and ES?L groups. In C. elegans model, the KPC-2, ES?L and community groups showed an LT50 of 9.65, 10.2 and 10.4 days, respectively. In G. mellonella model, there was no significant difference among the three groups evaluated, as observed in the bacterial fitness assay. Conclusion: This study demonstrated that the multi-drug resistant K. pneumoniae clinical isolates producing KPC-2 and ES?L were as virulent as those isolates recovered from the community, without significant loss in bacterial fitness, which contributed with their persistance in the hospital environment.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Condicionamento positivo à butanona em c. elegans: padronização do protocolo de aprendizagem associativa(Universidade Federal de São Paulo, 2022) Silva, Luiz Felipe Marquês da [UNIFESP]; Mello, Luiz Eugênio Araújo de Moraes [UNIFESP]; Cunha, Fernanda Marques da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4457893486819547; http://lattes.cnpq.br/4462750801249231; http://lattes.cnpq.br/1792787203352549Introdução: O C. elegans é um organismo modelo que vem cada vez mais ganhando notoriedade no meio acadêmico, pois é muito útil para o estudo do aprendizado e da memória em níveis celular e molecular. Desta forma, este projeto visou por incluir o C. elegans no acervo de espécies do grupo LE MELLO e inaugurar o estudo de sua aprendizagem no continente latino-americano. Objetivos: Implementar e adaptar um modelo de condicionamento positivo em C. elegans e investigar o seu processo de aprendizagem associativa. Materiais e métodos: Vermes hermafroditas da cepa selvagem (N2 Bristol) foram cultivos a 20º C em placas de petri com meio NGM e semeadas com E. coli HT115 ou OP50-1 em condição ad libitum até o primeiro dia da fase adulta. O aprendizado nos animais foi induzido através de um modelo de condicionamento apetitivo a odor e avaliado por meio de ensaio de quimiotaxia. Os períodos de retenção empregados no projeto foram: 0, 15, 30, 60, 120, 180, 210, 300 e 1440 minutos. A padronização do modelo de aprendizagem foi executada através do uso de placas personalizadas com adesivo para os ensaios de quimiotaxia e cultura bacteriana concentrada para a alimentação dos nematoides. Resultados: O perfil de aprendizagem caracterizado com E. coli HT115 no projeto revelou ser mais crônico que o estabelecido pela literatura com a cepa OP50. Os dados dos ensaios executados com E. coli OP50-1 tiveram alta variabilidade, contudo aparentam seguir a tendência prevista pela literatura. Para agilizar a contagem dos vermes nas fotografias dos ensaios, uma aplicação web foi desenvolvida para a semi-automação do processo. Conclusão: A dieta oferecida ao C. elegans, possivelmente, tem impacto sobre a sua capacidade de aprendizagem e de formação de memória associativa, devido as diferenças constitutivas e metabólicas existentes entre os microrganismos ofertados e suas variadas cepas.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Desvendando os efeitos não autônomos de Dicer no controle da proteostase celular em caenorhabditis elegans e camundongos(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-01-31) Pinca, Ana Paula Forti [UNIFESP]; Mori, Marcelo Alves da Silva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3425809117024031; http://lattes.cnpq.br/4169125445297423; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Age-related proteotoxicity is the major cause of neurodegenerative diseases like Alzheimer’s and Huntington’s. Small RNAs appear to be excellent candidates in controlling cellular proteostasis since they selectively inhibit protein synthesis, are expressed in temporal or tissue-specific manners, are regulated by interventions that affect lifespan, and act in cell autonomous and non-autonomous manners in multicellular organisms. Our aim in this study was to test if Dicer, which becomes rate-limiting in miRNA biogenesis with aging, is able to control the susceptibility to age-related proteotoxic stress as measured by paralysis and lifespan analyses in C. elegans, and by behavior and biochemical analyses in mice. First, we silenced Dicer in all tissues but the neurons in wild type N2 worms. Surprisingly, Dicer RNAi in adult N2 worms delayed age-related paralysis, and this was reversed when proteotoxicity was induced in muscle with overexpression of polyglutamine (polyQ) peptides. Muscle-, neuron- or intestine-specific Dicer RNAi did not affect the proteostasis in wild type or polyQ worms. Our data suggests a scenario where silencing of Dicer in all tissues except in the tissue where age-related proteotoxicity is more relevant confers beneficial effects. Consistent with a cell non-autonomous effect, some of our previouslyresults showed that intestine-specific Dicer overexpression accelerates age-related paralysis in muscle-selective polyQ worms. Thus, we may suggest there is a balance of Dicer levels among tissues that determines age-related proteostasis decline, in which higher levels in neurons vs. other tissues is beneficial. However, the effects of Dicer appear to be protein specific, since the same thing did not occur in worms that aggregate beta-amyloid proteins rather than polyglutamines. In addition, we have seen a small beneficial effect of Dicer knockout in the adipose tissue of transgenic male mice model for Alzheimer's disease, suggesting that Dicer possibly exerts some non-autonomous effect on cellular proteasase in mammals as well.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Efeitos e mecanismos da privação alimentar sobre o metabolismo mitocondrial de Caenorhabditis elegans(Universidade Federal de São Paulo, 2022-02-22) Santos, Felipe Macedo [UNIFESP]; Cunha, Fernanda Marques da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4457893486819547; http://lattes.cnpq.br/0813628381640019Introduction: Dietary deprivation was one of the most frequent evolutionary pressures. Because of that, living organisms developed complex mechanisms to survive those challenges. Mitochondria are dynamic organelles that respond to cellular signals and rewire their metabolism in order to maintain the cellular energy homeostasis. In Caenorhabditis elegans, as well as in other organisms, part of the response to dietary deprivation depends on the modulation of mitochondrial activity and signaling proteins such as AMP-activated protein kinase (AMPK), a sensor that coordinates the cellular response to energy unbalance. In this scenario, AMPK activation stimulates catabolic pathways and inhibits anabolic pathways, reestablishing the energetic balance. Objective: To evaluate the effects of bacterial deprivation, and the possible involvement of the AMPK kinase, on C. elegans mitochondria. Methods: N2 Bristol worms were used as wild-type strain. aak-2 (ok524) and AAK-2 CA (WBM60) strains were used as AMPK loss- and gain-of-function mutants, respectively. Early egg-laying adults from all groups were submitted to ad libitum or bacterial deprivation diets for 24 hours, and then harvested for assays. Respiratory rates were evaluated in vivo and in isolated mitochondria by high resolution respirometry. Mitochondrial mass was determined by citrate synthase activity in animal extracts. Mitochondrial membrane potential was determined by measuring differences in Safranine O fluorescence. Proton flux through inner membrane was indirectly evaluated by measuring oxygen consumption rates in different membrane potential values. Proteomics were conducted by digestion of proteins followed by separation and identification of peptides by liquid chromatography coupled to mass spectrometer. Results: Bacterial deprivation reduced the in vivo respiration of wild-type animals, an effect due, at least in part, to reduced mitochondrial mass. The same phenotype was observed on AMPK loss- or gain-of-function mutants, suggesting that bacterial deprivation-induced decrease in in vivo respiration is AMPK-independent. Bacterial deprivation increased complex I- and β-oxidation-supported respiration in mitochondria isolated from wild-type animals. However, this effect was not observed in mitochondria isolated from AMPK loss- or gain-of-function mutants, suggesting that a transitory activation of AMPK during dietary deprivation is necessary for mitochondrial metabolism rewiring. Membrane potential was not affected by bacterial deprivation or AMPK mutations. Twenty-five of the identified proteins in our proteomics analysis were differentially expressed in mitochondria from wild-type animals subjected to bacterial deprivation, with some of them being dependent on AMPK signaling to be remodeled. Conclusion: We have shown that bacterial deprivation impacts mitochondrial energy metabolism in C. elegans, and some alterations are AMPK-dependent. The bacterial deprivation-induced changes in mitochondrial activity are accompanied by remodeling of the mitochondrial proteome, which explains, at least in part, the increased respiratory capacity observed in mitochondria isolated from bacteria deprived wild-type worms. Our data suggest that oxidation of respiratory substrates at the electron transport chain is responsible for the bacterial deprivation-induced increased respiratory capacity. However, we do not exclude the participation of other parameters, such as alterations in mitochondrial morphology or cristae density, in the regulation of this process. In the future, it will be interesting to check whether those parameters are part of mitochondrial adaptation to bacterial deprivation as well as to unravel the effectors downstream AMPK that lead to mitochondrial phenotype remodeling.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Estudo do envolvimento da atividade mitocondrial na super-resposta à restrição calórica em Caenorhabditis elegans mutantes para lipl-5(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-09-28) Santos, Felipe Macedo [UNIFESP]; Cunha, Fernanda Marques da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4457893486819547; http://lattes.cnpq.br/0813628381640019; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Objective: To evaluate the involvement of mitochondrial activity on the slower consumption of lipid storages on C. elegans mutants for lipl-5 under calorie restriction. Methods: Wild-type animais N2 Bristol and lipl-5 mutants were submitted to 24 hours bacterial deprivation (BO). Metabolic rate were evaluated by in vivo O2 consumption and heat dissipation. Mitochondrial mass was analyzed by citrate synthase activity. Mitochondrial activity was evaluated by isolating these organelles from the worms and measuring O2 consumption supported by complex I, 11 and 13- oxidation substrates, separately. Results: Bacterial deprivation modulated the animais' metabolism, as indicated by decreased O2 consumption and heat generation in vivo on both strains, but to a lesser extent in lipl-5 mutants, since lipl-5 knockout, per se, modulated the worm's metabolism. The decreased in vivo O2 consumption was due to reduced mitochondrial mass, as assessed by citrate synthase activity. Oxidative capacity of mitochondria was modulated by BO, with enhanced phosphorylation capacity in complex I and l3-oxidation in wild-type mitochondria. In lipl-5 mutants, complex 11- but not complex 1- or l3-oxidation-driven. respiration was enhanced by BO. Indeed, it was observed that the mutation itself was capable of increasing complex I and l3-oxidation-driven respiration to similar levels of that measured in wild-type mitochondria from animais submitted to BO. Conclusion: lipl- 5 mutation probably triggers a yet unidentified stress signal, which leads to enhanced mitochondrial respiratory capacity. The fact that mitochondria form lipl-5 animal submitted to BO presented enhanced phosphorylation capacity towards complex I and II substrates may explain, at least in part, the lipid sparing observed in these animais upon BO. Besides that, the smaller extent of metabolic remodeling in lipl-5 mutants when submitted to BO might reduce energy resources consumption, that would diminish fat storages utilization for energy production.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Estudo dos efeitos de Dicer sobre a função mitocondrial, o metabolismo e o envelhecimento em nematoides C. elegans(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-08-31) Silva, Silas Pinto da [UNIFESP]; Mori, Marcelo Alves da Silva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3425809117024031; http://lattes.cnpq.br/3855491599849881; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Introdução e objetivos: O envelhecimento é uma das mais significativas tendências do século XXI e tem preocupado governos do mundo todo por sua implicação em inúmeros setores da sociedade. Entender como o tempo de vida é controlado é necessário para que estratégias sejam propostas com a finalidade de , garantir um envelhecimento saudável para a população. Sabe-se que o envelhecimento é uma sucessão de eventos biológicos que, como tantos outros, está sob controle biológico. Dentre outros, grupos de genes que controlam vias nutricionais e metabólicas mostram-se cada vez mais importantes no contexto do envelhecimento. Com o intuito de melhor entender o sistema descrito acima, procuramos respostas no estudo de um dos grandes efetores do controle da expressão gênica, os miRNAs e de Dicer, enzima chave no processamento dos mesmo, com o fim de avaliar qual o papel desta via para a regulação do metabolismo e do envelhecimento. Métodos: Foram-avaliados o tempo de vida, o declínio da função muscular associado à idade, a resistência ao estresse oxidativo e térmico, o tempo de desenvolvimento, a taxa de bombeamento da faringe, a espressão global de miRNAs, a fertilidade, a respiração basal, o conteúdo lipídico, a quantificação de ATP e a quantidade de mitocôndrias em vermes mutantes ou selvagem tratados com estressores ou fármacos que promovem a saúde dos vermes. Resultados: Nossos dados sugerem que o silenciamento de Dicer, enzima chave é extremante deletério em nematoides C. elegans levando à diminuição do tempo de vida de vermes selvagens e retardando seu desenvolvimento. Adicionalmente, esta intervenção promove diminuição da respiração, causa estresse oxidativo e inibe os efeitos benéficos de mutações ou intervenções que dependem da função mitocondrial para estender o tempo de vida. Além disso, o enoxacino, um fármaco que ativa o processamento de miRNAs age de maneira contrária, melhorando a saúde dos vermes de maneira dependente do miRNA mir-34.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Investigação da participação da AMPK em aspectos do catabolismo lipídico induzido pela privação alimentar(Universidade Federal de São Paulo, 2023-05-25) Silva, Sofia Beatriz e [UNIFESP]; Cunha, Fernanda Marques da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4457893486819547; http://lattes.cnpq.br/7396862311964036Objetivo: Investigar a participação da Proteína Quinase Ativada por Adenosina Monofosfato (AMPK) em aspectos do catabolismo de lipídios induzido pela privação alimentar. Métodos: A contribuição da β-oxidação para a longevidade de animais selvagens e animais com ganho ou perda de função da AMPK foi analisada em condições ad libitum ou de privação de alimento na ausência ou presença perhexilina, inibidor farmacológico da entrada de ácidos graxos de cadeia longa na matriz mitocondrial. A contribuição da AMPK na manutenção da saúde foi analisada em animais adultos com perda ou ganho de função para AMPK e sua movimentação foi medida em líquido nos dias 1, 5 e 10 de vida adulta. Para definir o impacto da alteração da atividade da AMPK e da privação alimentar sobre a abundância de lipídios neutros, animais adultos foram ou não submetidos a 6 horas de privação alimentar, e posteriormente corados com Oil-Red O. A participação da AMPK sobre o controle da expressão de proteínas envolvidas no catabolismo de lipídios foi investigada por meio da quantificação de RNA mensageiro, realizada em animais controle ou privados de alimento por 6 horas. O perfil temporal de ativação da AMPK em resposta à falta de alimento, foi determinado pela quantificação da fosforilação da treonina 172 da enzima por western blotting em animais selvagens submetidos à privação alimentar. Resultados: A privação alimentar aumenta o tempo de vida de animais selvagens, sendo que esse aumento depende da β-oxidação. A perda de função para AMPK diminui o tempo de vida em condições ad libitum e previne totalmente o aumento do tempo de vida induzido pela privação alimentar. O ganho de função para AMPK tem o efeito oposto, aumentando o tempo de vida em condições ad libitum assim como a resposta à privação alimentar. Em animais com AMPK constitutivamente ativa, há menor perda de movimentação durante o envelhecimento quando comparado à linhagem selvagem ou com perda de função para AMPK. O ganho ou perda de função da AMPK não parece afetar o consumo de lipídios de reserva e a expressão de enzimas do catabolismo lipídico após 6 horas de privação de alimentos em comparação ao grupo selvagem Por fim, a ativação da AMPK parece ser tardia, porém duradoura. Conclusões: A AMPK tem ativação tardia, em resposta à privação alimentar. A ativação dessa enzima é necessária para o aumento no tempo de vida em resposta à privação alimentar, assim como para a manutenção da saúde do animal durante o envelhecimento em dieta ad libitum. Seis horas de privação alimentar levam ao consumo de lipídios corporais, assim como à alteraçaõ da expressão de enzimas envolvidas no catabolsimo de lipídios, efeitos que não parecem depender da AMPK.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Varredura fenotípica de nematoides C elegans mutantes para proteínas necessárias para a via de RNAi sistêmica(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-05-30) Camara, Henrique [UNIFESP]; Mori, Marcelo Alves da Silva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3425809117024031; http://lattes.cnpq.br/9774948524135567; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Background and objective: SIDs and RSDs are proteins required for double stranded RNA transport in C. elegans. The mutants for their coding genes have tissue specific systemic RNAi defects. SID-2 is important for the incorporation of RNA from the environment to the organism, without a role in the transport of endogenous RNAs. RSD-3, RSD-2 e RSD-6 are specific for the transport to the germline, althought rsd-2 and rsd-6 mutants shows RNAi defects in the intestine. SID-1, SID-3 e SID-5 transport RNA to all non-neuronal tissues. Some of these proteins are conserved in more complex organisms, including humans, and assist the gene silencing produced by mobile RNAs. The mechanisms through which SIDs and RSDs mediate RNA transport are well described, but little is known about their roles in worm physiology. Therefore, the present work was conducted to identify physiological roles of SIDs and RSDs. Methods: We assessed the lifespan and age-related muscular function decline, oxidative and heat stress resistance, time of development and fertility in worms lacking functional SIDs and RSDs. Results: Systemic RNAi deficient worms reached adulthood, but the developmental time was delayed in sid-2, rsd-2, sid-1, sid-5 and sid-3 mutants. Mutations that impair RNA transport to the germline, with exception of sid-1, reduced brood size. In contrast, impaired systemic RNAi in somatic tissues, but not in the germline, rendered worms short-lived. Interestingly, the median lifespan was inversely correlated with the number of RNAi deficient somatic tissues (e.g. N2 = rsd-3 >rsd-2 > sid-1). The reduction in lifespan of some sid and rsd mutants was accompanied by premature age-related muscular dysfunction , assessed by reduced spontaneous contraction of the pharynx and the body-wall muscle, and reduced oxidative and heat stress resistance. Conclusions: Collectively, our data demonstrate that SIDs and RSDs are necessary in the germline for proper fertility. In different somatic tissues, but notably in the intestine, these proteins are necessary for normal development, longevity and stress resistance. This indicates that mobile RNAs are physiologically used as signaling molecules to control organismal homeostasis. These results provide insights into novel mechanisms of intertissue communication in multicellular organisms.